原文翻译
所有报告基因的设计原则为：确保表达的 mRNA（包括启动子区域与终止信号）不含任何 DRACH 基序或 mcm⁵s²U 依赖性密码子，除非是实验中刻意引入的序列。所有元件均由南京金斯瑞（GenScript）合成，并通过标准分子克隆或吉布森组装（Gibson assembly）方法克隆至 pcDNA3.1 (+) 载体（赛默飞世尔）中。
研究使用mCherry 基因作为表达内参：该基因已通过同义密码子替换，移除了所有含 m⁶A 的 DRACH 基序与 mcm⁵s²U 依赖性密码子。
在 CMV 启动子控制下，克隆N 端带 V5 标签、不含 DRACH 基序与 mcm⁵s²U 依赖性密码子的 mNeonGreen 序列，其后连接一段由12 个重复 DRACH 基序或12 个重复 DRAGH 基序组成的片段。针对每个密码子特异性片段，选取GLORI 数据（Liu 等，文献 13）中显示 m⁶A 修饰水平最高、且包含目标密码子的 3 种 DRACH 序列基序，将其串联后再重复 4 次，最终构成 12× 重复单元。
为构建3′UTR 报告基因，将 mNeonGreen 与 12×DRACH 基序之间的CGA 密码子替换为TGA 终止密码子。
该方法详细介绍（原理 + 设计 + 用途）
1. 方法核心目的
严格控制变量，精准验证：mRNA 上不同位置的 m⁶A，是否会导致降解差异。只改变 m⁶A 位置 / 有无，不改变其他任何可能影响翻译、降解的序列。
2. 报告基因设计的 4 个关键原则（原文严格遵守）
（1）完全剔除背景干扰序列
载体、启动子、终止子、荧光蛋白全部不含 DRACH（避免自发 m⁶A 修饰） 全部不含mcm⁵s²U 依赖性密码子（避免 tRNA 修饰干扰） 目的：只有实验插入的 DRACH 能被 m⁶A 修饰，无背景噪音
（2）内参对照：mCherry
同样做了同义密码子全替换，无 DRACH、无 mcm⁵s²U 依赖密码子 用于校正转染效率、RNA 提取效率、荧光表达差异 保证降解速率的变化是目标报告基因的变化，不是系统误差
（3）核心报告单元：mNeonGreen + 12×DRACH/DRAGH
mNeonGreen：无 DRACH、无 mcm⁵s²U 依赖密码子 12×DRACH：可被 METTL3 甲基化，产生 m⁶A 12×DRAGH：DRACH 突变体，不能被甲基化，作为负对照 12 个重复：强化 m⁶A 信号，让降解差异更易被检测
（4）单碱基突变实现位置切换
- CDS 报告基因：mNeonGreen 后是
- 3′UTR 报告基因：仅把 CGA →
两个报告基因几乎完全一样，只差 1 个碱基→ 完美控制变量：唯一变量是 m⁶A 在 CDS 还是 3′UTR
3. 密码子特异性设计（GLORI 数据指导）
依据 GLORI 单碱基绝对定量 m⁶A 数据 挑选m⁶A 修饰率最高的 3 种 DRACH 串联并重复 4 次 → 12× 目的：让报告基因的 m⁶A 修饰强、稳定、可重复
4. 最终得到 3 组关键报告基因
- CDS-m⁶A：DRACH 在编码区 → 可甲基化
- 3′UTR-m⁶A：DRACH 在 3′非翻译区 → 可甲基化
- CDS-no m⁶A：DRAGH 在编码区 → 不可甲基化（负对照）
5. 该方法在本文中的科学作用
直接因果证明：CDS 中的 m⁶A 才会加速 mRNA 降解 排除序列长度、密码子偏好、RNA 结构等所有混淆因素 是本文从组学相关性 → 实验因果的关键支撑实验
结果展示：
(D) 用于检测 m⁶A 位置效应的报告基因载体。m⁶A 修饰的 DRACH 片段分别位于 3′UTR（紫色）、CDS（绿色），或 CDS 中突变为不可甲基化的 DRAGH 片段（蓝色）。(E) 经放线菌素 D（左）或雷公藤内酯（右）关闭转录后，HEK293T 细胞中报告基因 mRNA 的降解。颜色方案同 (D)。(F) 经模拟处理（灰色）或 METTL3 抑制剂 STM2457 处理（橙色）的 HEK293T 细胞中报告基因 mRNA 的降解。
