多肽固相合成（SPPS）是多肽药物生产的常用方法，通过将每个氨基酸依次引入固相载体（即树脂）上得到目标多肽，再使用强酸处理（例如TFA）将多肽从固相载体上切割下来。美国化学学会绿色化学研究所药物圆桌会议（ACS GCIPR）正在推动多肽合成方法的绿色可持续转变，以期最大限度减少对环境的伤害，其中就包括替代有害溶试剂，例如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶和三氟乙酸（TFA），这些有害物质会对人类健康构成风险，并对生态环境造成较大影响。
Jiuzhou News
TFA是一种多氟烷基物质（PFAS）（PFAS类化学物质在环境中难以降解，对人类健康和生态系统危害较大），TFA是易挥发的强酸，能迅速被人体组织吸收，对皮肤和呼吸系统有强腐蚀性，即便是在实验室小规模合成中也存在一定风险。在大规模生产中，TFA的使用量更大，风险也更高，寻找合适的TFA替代品是多肽“绿色”生产的重点。
Pawlas等近期提出将Brønsted–Lowry acids和Lewis acids（如HCl/FeCl3或者乙酸/FeCl3）与极性溶剂（如碳酸二甲酯DMC和乙腈）结合，作为替代TFA的无PFAS裂解剂。MSA是另一种替代TFA的绿色溶剂。MSA具有极低的蒸汽压和高沸点，常规条件下不会释放有害挥发性物质；MSA具有较低的pKa值（-1.86），酸性相对TFA更强，多肽裂解中具有相对较低的使用浓度；并且MSA易于生物降解，最终生成硫酸盐和二氧化碳，环境风险较低。
作者在以往的研究中发现MSA的裂解效果与溶液组成相关，MSA混合的溶剂不同，浓度不同，其裂解效果也不同。与极性溶剂相比，MSA在二氯甲烷（DCM）中似乎更有效，但DCM较为危险，环境风险也较高。
本文作者提出以2%甲磺酸（MSA）甲酸（FA）为溶剂，以三异丙基硅烷（TIS）为清除剂，进行多肽裂解脱保护。研究表明，2% MSA和FA可在2—3小时内成功脱除所有保护基，对于易出现甲酰化的多肽（含有丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、色氨酸Trp、酪氨酸Tyr），可通过0.5 M氨水处理去除甲酰化。与传统TFA裂解方法相比，使用MSA-Tis-FA（2:2.5:95.5）进行裂解，可生物降解的甲磺酸（MSA）替代了属于PFAS类、具有环境持久性的三氟乙酸（TFA）。，且强酸使用浓度显著降低，从TFA体系的95%降至MSA体系的2%，还表现出不低于传统THA方法的裂解产率。
1. 实验
1.1SPPS的一般流程
所有模型多肽的合成均采用标准Fmoc/tBu固相合成方案（SPPS）。Fmoc-RinkAmide AM-PS树脂（loading 0.67 mmol/g）、PS-PEG-RinkAmide树脂（loading 0.37 mmol/g）、Wang树脂（loading 0.57 mmol/g）被用作合成模型多肽的固相载体。树脂用DMF溶胀30 min，再经DMF洗涤。Fmoc基团通过20%哌啶DMF溶液处理除去，再用DMF洗涤。Fmoc-氨基酸单体（3.0 eq.）在室温下用DIC（3.0 eq.）和OxymaPure（3.0 eq.）在DMF中偶联1小时。以上步骤交替进行，直到完成模型多肽的合成。
1.2模型多肽合成
本文研究合成了下列模型多肽：
1）Leu-enkephalin pentapeptides (H-YXXFL-NH2)
使用Fmoc-RinkAmide AM-PS树脂（loading 0.67 mmol/g）合成Leu-enkephalin pentapeptides (H-YXXFL-NH2）。
2）Semaglutide (SGT) 8-mer
使用Wang树脂（loading 0.57 mmol/g）合成Semaglutide (SGT) 8-mer。
3）Tirzepatide 18-mer (H22-39-NH2), ABRF, bradykinin, and ACP decapeptide
合成方法参照Leu-enkephalin pentapeptides (H-YXXFL-NH2）。
4）Tirzepatide (TZP, H1-39-NH2)
使用PS-PEG-RinkAmide树脂（loading 0.37 mmol/g），按照Leu-enkephalin pentapeptides (H-YXXFL-NH2）的标准方案合成。
1.3多肽常规裂解步骤（TFA法）
常规裂解剂为TFA-TIS-H2O (95:2.5:2.5），室温反应2小时进行裂解，然后用冷乙醚沉淀，得到粗肽。粗肽以乙腈/水溶解后，用HPLC和LCMS进行分析。
1.4利用MSA进行多肽裂解
所用MSA裂解剂组成为MSA-TIS-FA (2.0:2.5:95.5）。将肽树脂（10 mg）置于离心管中，加入MSA裂解液（0.2 mL/10 mg树脂），室温振荡2-3 h（含His多肽为40℃振荡）。振荡结束后，收集滤液，加入冷乙醚沉淀，离心去除上清液，干燥，重复上述过程两次，得到粗肽。粗肽以乙腈/水溶解后，用HPLC和LCMS进行分析。
2.结论
研究者们开展了一系列基于不同模型多肽的裂解对比实验，发现无论是结构简单的短肽（Leu-enkephalin pentapeptides）抑或结构复杂的长肽（Tirzepatide），利用MSA进行多肽裂解后，其粗品纯度和裂解产率与TFA裂解结果较为类似，实验结果表明，MSA-FA体系在多肽裂解中具有良好的应用潜力，可作为TFA的一种绿色替代方案。与常规TFA裂解相比，MSA-FA具有许多优势（表 1）。例如以FA作为溶剂，其极性高，有助于多肽在冷乙醚中的沉淀。强酸使用浓度较低，2%的MSA便可实现完全裂解，尽管MSA-FA体系会导致Ser、Thr、Trp、Tyr发生甲酰化，但是通过0.5 M氨水处理也能有效去除。该体系在操作安全性与环境影响方面具有一定优势，更加符合Paul Anastas所提出的“绿色化学十二原则”。
表 1 常规TFA裂解和MSA裂解方法对比
参考资料
1.10.1039/d5gc04192a
2.10.1002/cssc.202402752
3.10.1021/acs.joc.8b03001
4.10.1021/acs.orglett.4c02569
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