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运动模拟物研究报告:MOTS-c 以 PGC-1α/AMPK 依赖性方式改善肌肉线粒体内在生物能健康与效率

Free Radical Biology and Medicine:MOTS-c 以 PGC-1α/AMPK 依赖性方式改善肌肉线粒体内在生物能健康与效率

出处： Gudiksen A, Hansen CC, van der Stede T, Daugaard AH, Schmidt JH, Ringholm S, Merimi M, Al-Obaidi FR, Kristoffersen AT, Zole E, Regenberg B, Kjøbsted R, Wojtaszewski J, Hellsten Y, Pilegaard H. MOTS-c improves intrinsic muscle mitochondrial bioenergetic health and efficiency in a PGC-1α/AMPK-dependent manner. Free Radic Biol Med. 2026 Mar 16;246:682-696.

作者介绍：

Abstract

摘要

线粒体来源肽是一类由线粒体 DNA 中短开放阅读框编码的小型调节肽。其中一种肽，即 12S rRNA-c 线粒体开放阅读框肽（MOTS-c），在外源性给予后已被证明可对全细胞和系统性代谢指标产生多种有益作用。然而，MOTS-c 介导的潜在线粒体生物能学效应在很大程度上被忽视。因此，本研究的主要目的是阐明 MOTS-c 是否以及如何调节骨骼肌（SkM）线粒体功能。我们使用两种不同的转基因小鼠品系证明，给予 MOTS-c 可增强肌肉线粒体生物能表现，并且这一过程依赖于转录共激活因子 PGC-1α 和细胞能量感应激酶 AMPK。这些效应似乎并不明显影响线粒体呼吸蛋白含量，提示其主要涉及线粒体内在改变，而非线粒体数量变化。此外，MOTS-c 处理降低了线粒体活性氧（ROS）释放和 ROS 相关蛋白损伤，表明其可显著减轻细胞氧化应激。RNA 测序数据显示，MOTS-c 处理的作用可能较为微妙地分布于多个线粒体参数，包括氧化还原处理、线粒体完整性和 OXPHOS 效率，共同提示了观察到的线粒体生物能功能改善的机制基础。尽管人体单腿膝伸肌运动期间间质 MOTS-c 水平升高，但动静脉差值未发生变化。这提示骨骼肌可能并不是运动反应中循环 MOTS-c 的来源。

Introduction

前言

线粒体功能对于维持细胞能量稳态至关重要。高应激状态可打破能量稳态平衡，并可能对细胞过程产生持久的不良影响。越来越多的证据表明，线粒体通过释放线粒体 DNA 编码因子，在日益广泛的调节性和保护性反应中发挥着关键但复杂的作用。其中包括线粒体来源微蛋白（mitochondrial-derived microproteins，MDP）¹˒²，这类小型调节肽来源于 mtDNA 中短开放阅读框（short open reading frames，sORF）编码的转录本。目前已有多种 MDP 被证明具有不同的代谢有益特性，而其中 12S rRNA-c 线粒体开放阅读框肽（mitochondrial open reading frame of the 12S rRNA-c，MOTS-c）表现出尤其具有前景的潜力，该肽首次发表于 2015 年³。

MOTS-c 由人线粒体 12S rRNA 基因中的一个 51 碱基对 sORF 编码，翻译产生一个由 16 个氨基酸组成的肽，其中前 11 个氨基酸在哺乳动物物种之间似乎高度保守。在小鼠中给予 MOTS-c 可对代谢稳态产生有益作用，并似乎能够调节细胞核苷酸、葡萄糖和脂肪酸代谢，从而逆转年龄相关性以及高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和肥胖³˒⁴。此外，小鼠接受 MOTS-c 注射 8 周后，全身产热增加³，提示能量消耗增强。然而，诱导这些效应的机制仍不明确，但可能由骨骼肌线粒体功能改善所驱动。

既往研究描述了运动训练可增加 C57BL/6J 小鼠骨骼肌中的 MOTS-c 蛋白含量⁵˒⁶，但在人类研究中则存在相互矛盾的证据⁴˒⁷。此外，有研究报道运动训练可增加小鼠和/或人骨骼肌中的 MOTS-c mRNA 或蛋白⁵˒⁶。这可能提示 MOTS-c 在介导运动训练诱导的骨骼肌代谢适应中发挥作用。这种有益的运动反应可部分通过线粒体生物能活性和/或含量的适应性改变实现。线粒体生物发生和功能中的一个重要因子是 PGC-1α，它可促进一系列线粒体相关靶基因的转录⁸˒⁹。单次运动也已被证明可上调大鼠¹⁰、小鼠¹¹和人¹²˒¹³骨骼肌中转录共激活因子 PGC-1α 的转录和 mRNA 含量。此外，产热/解偶联效应与 PGC-1α 激活有关，并提示 PGC-1α 还通过提高 ATP 合成效率和解偶联能力参与抑制线粒体 ROS 释放¹⁴˒¹⁵。与此一致，MOTS-c 已被认为可上调基础产热活性³。同样，细胞培养研究提示 MOTS-c 与 PGC-1α 之间存在双向调控⁵˒⁶，并且有研究报道运动训练可在小鼠骨骼肌中诱导 MOTS-c 和 PGC-1α 蛋白含量同步增加⁶。这提示 PGC-1α 与 MOTS-c 之间可能存在一个调控反馈轴，并可能对线粒体功能产生增强作用，但这一点仍需在更稳健的生理模型中加以证实。

单次运动可诱导啮齿动物和人骨骼肌中细胞内能量感应因子 AMPK 的激活¹⁶˒¹⁷，而骨骼肌中运动诱导的 PGC-1α mRNA 含量增加已有报道称部分受 AMPK 调控¹⁸。此外，骨骼肌中 AMPK 的药理性激活已被证明可增加线粒体生物发生，而 AMPK 对线粒体基因的作用几乎完全依赖于 PGC-1α¹⁹˒²⁰。MOTS-c 给药也已被证明可激活 AMPK³˒⁶˒²¹。综合来看，这提示 AMPK-PGC-1α-MOTS-c 轴可能介导了在较简单模型中观察到的 MOTS-c 有益作用。然而，PGC-1α 和 AMPK 在 MOTS-c 介导效应中的确切作用在很大程度上仍不清楚。

已有发现表明，单次运动可增加骨骼肌中的 MOTS-c mRNA 和/或蛋白，同时伴随循环 MOTS-c 水平同步升高，因此有人提出 MOTS-c 可能在运动过程中由骨骼肌释放²²。然而，需要强调的是，迄今尚无研究为这一机制提供证据。因此，MOTS-c 是否属于运动诱导的肌源性因子仍有待确定。

基于上述观察结果，可以合理假设 MOTS-c 能够改善线粒体能力和质量。因此，本研究旨在阐明 MOTS-c 是否调节骨骼肌线粒体功能，以及这种作用是否依赖于 PGC-1α 和/或 AMPK，并独特地采用最先进的诱导型小鼠模型进行研究。此外，本研究还旨在考察 PGC-1α 是否是运动诱导和运动训练诱导骨骼肌 MOTS-c 水平调控所必需的。最后，本研究旨在明确骨骼肌 MOTS-c 是否确实是人体运动诱导循环 MOTS-c 升高的来源。

Methods

研究材料与方法

小鼠实验

本研究使用 8 周龄诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（iMKO）小鼠²³、诱导型肌肉特异性 AMPKα1α2 双敲除（iMDKO）小鼠²⁴以及同窝 lox 对照（CTRL）小鼠。连续 3 天腹腔注射（IP）tamoxifen（80 mg/kg），并分别在最后一次 tamoxifen 注射后 2 周和 3 周开始实验方案，以实现 PGC-1α 和 AMPKα1/α2 的最佳删除。动物饲养于 12:12 h 明暗循环条件下，可自由摄取普通饲料（Chow，SAFE® D30，SAFE DIETS，Rosenberg，Germany）和饮水。本研究共使用 200 只小鼠，涵盖所有品系。对于每一种小鼠品系，根据基因型选择 10–11 只小鼠，并随机分配至各实验组。样本量基于大量采用相似干预的前期研究确定。

身体成分

采用 EchoMRI（EchoMRI 4in1，EchoMRI，Houston，TX，USA）通过磁共振成像测定总体脂肪量和瘦体重。

代谢笼与能量消耗

在处死前 1 周，于部分雌性小鼠中使用代谢笼（PhenoMaster，TSE Systems，Bad Homburg，Germany）测定能量消耗、呼吸交换率（RER = CO₂ 释放量/O₂ 摄取量）和自主活动。小鼠在代谢笼环境条件下适应至少 2 天，随后进行 24 h 数据采集。每 15 min 测量氧气和 CO₂ 通量，并通过光栅系统记录光束中断次数，作为动物自主活动的指标。数据结果分为光照期和黑暗期，激光束中断次数计算为每小时平均值。

急性运动方案

20 只雌性和 20 只雄性 PGC-1α iMKO 小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠被分配进行急性运动方案。每种基因型 10 只小鼠（由 5 只雌性和 5 只雄性组成）在正式急性跑台运动前连续 5 天适应跑台。急性运动包括 1 h 跑台运动，速度为 15 m/min，坡度为 10°（TSE Systems GmbH，Bad Homburg，Germany）。运动小鼠在恢复 2 h 时通过颈椎脱臼处死，而对照小鼠保持安静状态，并在与运动小鼠相同的时间处死。迅速取出股四头肌，并立即置于液氮中冷冻，用于后续分析。

运动训练方案

雌性 PGC-1α iMKO 小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠单笼饲养 5 周，其中一半小鼠可使用跑轮（Techniplast activity cage，wheel ø:23 cm；Tecniplast S.p.A.，Buguggiate VA，Italy）。CTRL 小鼠的跑轮偶尔被锁定，以使两种基因型小鼠的跑动距离相近。所有跑轮均在处死前 24 h 锁定。干预结束后，小鼠通过颈椎脱臼处死，迅速取出一侧股四头肌，并置于液氮中冷冻，随后储存在 −80 ℃，用于后续分析。

单次注射方案

雌性和雄性 PGC-1α iMKO 小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠单次腹腔注射 MOTS-c（5.0 mg/kg，Shaanxi Jeujon Bio-tech LTD，China；溶于生理盐水）或生理盐水，并在注射后 3 h 通过颈椎脱臼处死。股四头肌立即置于液氮中冷冻，并储存在 −80 ℃，用于后续分析。所采用的高浓度和给药持续时间基于既往发表的 MOTS-c 干预研究³˒²⁵。所用合成 MOTS-c 肽为高质量级别（CAS 号 1627580-64-6），经 HPLC 分析显示其纯度极高（≤99%）。通过凝胶电泳检测发现，该重组肽具有预期的 2–8 kDa 分子量。

重复注射方案

雌性 PGC-1α iMKO 小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠，以及 AMPKα1/α2 iMDKO 小鼠及同窝 lox 对照（CTRL）小鼠（每组 n = 10–13）接受 MOTS-c（5.0 mg/kg；Shaanxi Jeujon Bio-tech LTD，China；溶于生理盐水）或生理盐水腹腔注射，每周 5 天，持续 4 周（共 20 次注射）。小鼠按每笼 8–10 只分组饲养，不同基因型小鼠共同饲养，并可自由摄取普通饲料（Chow，SAFE® D30，SAFE DIETS，Rosenberg，Germany）和饮水。干预结束后，小鼠通过颈椎脱臼处死，收集躯干血，并迅速取出股四头肌。一侧股四头肌外侧部分立即置于 BIOPS 缓冲液中（50 mM K-MES、7.23 mM K₂EGTA、2.77 mM CaK₂EGTA、20 mM imidazole、20 mM taurine、5.7 mM ATP、14.3 mM phosphocreatine 和 6.56 mM MgCl₂，pH 7.1），用于高分辨率呼吸测定；另一侧股四头肌立即置于液氮中冷冻，并储存在 −80 ℃，用于后续分析。

血浆 MOTS-c。按照制造商说明，使用小鼠 MOTS-c ELISA 试剂盒（MyBioSource，#MBS2090467，San Diego，CA，USA）测定血浆 MOTS-c 蛋白。

线粒体呼吸与H₂O₂ 释放

从一侧股四头肌外侧部分分离重量为 1–3 mg 的肌纤维束，并在 BIOPS 缓冲液中加入 30 μg/mL saponin，于 4 ℃ 透化 30 min。随后将透化后的肌纤维束置于冰冷的线粒体呼吸介质中清洗 30 min（MiR05；0.5 mM EGTA、3 mM MgCl₂、60 mM lactobionate、20 mM taurine、10 mM KH₂PO₄、20 mM HEPES 和 110 mM D-sucrose，并含 1 g/L bovine serum albumin），再开始分析。采用 Oxygraph-2k 系统（Oroboros Instruments GmbH，Innsbruck，Austria）在 37 ℃、高氧条件下进行重复高分辨率呼吸测定，O₂ 浓度约为 450–200 μM。

使用 O2k-Fluo LED2-Module（Oroboros Instruments GmbH，Innsbruck，Austria）在测量 O₂ 消耗的同时测定 H₂O₂ 释放（定义为从线粒体基质逸出的 H₂O₂）。简言之，加入 superoxide dismutase（30 U/mL）、horseradish peroxidase（HRP）（4 U/mL）和 Amplex Red（10 μM），以促使超氧化物转化为 H₂O₂，并伴随 HRP/H₂O₂ 介导的 Amplex Red 向 resorufin 转化，通过 570/585 nm 激发/发射荧光进行追踪。实验方案首先加入 oligomycin，随后分两步滴定 0.1 μM H₂O₂，以校正 resorufin 荧光信号的非线性。加入 pyruvate、malate 和 glutamate 以测定 Complex I 相关 LEAK 呼吸和 H₂O₂ 释放，随后进行 H₂O₂ 校准，并加入 succinate 以测定 Complex I + II 相关 LEAK 呼吸和 H₂O₂ 释放。在另一方案中，加入 pyruvate（5 mM）、malate（2 mM）和 glutamate（10 mM）以测定 Complex I 相关 LEAK 呼吸，随后滴定 ADP（0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、4.0 mM），以评估 ADP 动力学和偶联呼吸，作为氧化磷酸化（OXPHOS）能力的指标。加入 succinate（10 mM）后测定 Complex I + II 相关 OXPHOS 能力。

RNA 提取与逆转录

从AC16心肌细胞基因组DNA中扩增YTHDF2启动子区域的功能结构域，并将其插入pGL3-Basic载体（MluI-XhoI）中。HEK293T细胞先在12孔板中使用Lipofectamine 2000 Reagent（Invitrogen）转染2 μg EP300敲低质粒24 h；随后再共转染40 ng Renila和2 μg突变型YTHDF2报告载体24 h。按照厂家说明，采用双荧光素酶报告检测试剂盒（Beyotime）检测firefly和renilla荧光素酶活性。

实时 PCR

采用 QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）、Taqman 探针、Universal Mastermix（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）以及由所有样本混合样本连续稀释获得的相对标准曲线进行实时 PCR。用于检测 MOTS-c、PGC-1α mRNA exon 4–5（代表被删除片段）和 PGC-1α mRNA exon 9–10（代表全长）的引物以及 5′-FAM 和 3′-TAMRA 标记的 TaqMan 探针，使用 Primer Express 3.0 软件（Applied Biosystems）设计，并由 TAG Copenhagen（Copenhagen，Denmark）合成。

用于检测 MOTS-c cDNA 片段的引物和 TaqMan 探针序列为：

FP：5′ TTATATCCATCTAGAGGAGCCTGTTCT 3′，

RP：5′ AAGATGGCGGTATATAGGCTGAAT 3′，

TaqMan probe：5′ AATCGATAAACCCCGCTCTACCTCACCA 3′；

用于检测 PGC-1α exon 4–5 cDNA 片段（PGC-1α KO 中被删除）的序列为：

FP：5′ AACCACACCCACAGGATCAGA 3′，

RP：5′ TCTTCGCTTTATTGCTCCATGA 3′，

TaqMan probe：5′ CAAACCCTGCCATTGTTAAGACCGAGAA 3′；

用于检测 PGC-1α exon 9–10 cDNA 片段的序列为：

FR：5′ AGCCAAACCAACAACTTTATCTCTTC 3′，

RP：5′ TTAAGGTTCGCTCAATAGTCTTGTTC 3′，

TaqMan probe：5′ AGAGTCACCAAATGACCCCAAGGGTTCC 3′。

靶标 cDNA 含量根据每个 cDNA 样本的单链（ss）DNA 含量进行标准化，ssDNA 含量采用 Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent Kit（#O11492，Invitrogen，Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA）测定，方法如既往所述²⁷。

RNA-seq

对于 RNA-seq，使用 NEBNext rRNA Depletion Kit v2（Human/Mouse/Rat）和 NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina；条形码标记使用 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（96 Unique Dual Index Primer Pairs）（New England Biolabs，Ipswich，USA），并按照制造商方案进行。RNA 经多重化处理后，在 Novaseq 6000（Illumina，Inc.，San Diego，USA）SP flow cell 上进行 2 × 75 核苷酸双端测序，平均每个样本获得 2500 万条单端读段（测序由 Rigshospitalet，Denmark 完成）。

裂解液制备

将约 25 mg 粉碎的股四头肌组织置于冰冷缓冲液中匀浆，该缓冲液含 HEPES（50 mM）、glycerol（10%）、Na-pyrophosphate（20 mM）、NaCl（150 mM）、NP-40（1%）、B-glycerophosphate（20 mM）、NaF（10 mM）、EDTA（1 mM）、EGTA（1 mM）、aprotinin（20 μg/mL）、leupeptin（10 μg/mL）、Na₃VO₄（2 mM）和 benzamidine（3 mM）。使用 TissueLyser II（Qiagen，Valencia，CA，USA）以 30 次/s 振荡 2 min 进行匀浆。随后于 4 ℃ 端对端旋转 1 h，再于 4 ℃、16,000 g 离心 20 min，方法如既往所述²⁸。采用 bicinchoninic acid 法（Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，USA）测定裂解液总蛋白含量。裂解液加入含 sodium dodecyl sulfate（SDS）的上样缓冲液，制备 western blotting 样本，方法如既往所述²⁹。

SDS-PAGE 与 western blotting

在测定 OXPHOS 蛋白含量后，western blotting 样本于 96 ℃ 煮沸 3 min。通过在手工灌制凝胶上加载等量蛋白，并随后使用 PVDF 膜（Immobilon-P Transfer membranes，Millipore，Bedford，MA，USA）和半干转膜进行 western blotting，以测定特定目标蛋白含量，方法如既往所述²⁸。采用 Ponceau 染色以确保蛋白从凝胶向膜的均匀转移。使用以下抗体检测相关蛋白：AMPKα1 protein（由 Lund University，Sweden 的 Professor Olga Goransson 惠赠）、AMPKα2 protein（Santa Cruz sc-19131）、AMPKThr172 phosphorylation（Cell Signaling #2535）、ANT1 protein（Thermo Fischer PA5-05074）、Catalase protein（Abcam ab1877）、MFN2 protein（Cell Signaling #9482）、Mitofilin protein（Proteintech 10179-1-AP）、MOTS-c protein（MyBioSource MBS542112）、OPA1 protein（BD Biosciences #612606）、OXPHOS proteins（Abcam ab110413）、SOD2（Millipore/Upstate 06–984）、UCP3 protein（Abcam ab180643）以及 PDH-E1α protein（由 University of Dundee，Scotland/UK 的 Professor Grahame Hardie 惠赠）。

Citrate synthase 活性

将肌肉组织置于含 0.05% bovine serum albumin 的 0.3 M phosphate buffer（pH 7.7）中匀浆，并使用 TissueLyser II（Qiagen，Valencia，CA，USA）以 30 次/s 振荡 2 min。按照制造商方案（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）测定最大 citrate synthase 活性，并在基线及加入 oxaloacetate 后于 405 nm 动态测定吸光度（Multiscan，Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）。

蛋白羰基化

按照制造商方案，使用 OxiSelect™ STA-307 荧光测定试剂盒检测羰基化（Cell Biolabs，CA，USA）。简言之，骨骼肌组织蛋白裂解液与 carbonyl fluorophore 孵育过夜。随后使用 trichloroacetic acid 沉淀蛋白，并用 acetone 清洗沉淀以去除游离荧光团。最终产物溶解于 guanidine hydrochloride 中，并通过荧光法测定羰基含量，同时与平行运行的新鲜荧光团标准品进行比较。

人体实验

本研究纳入 7 名男性受试者（年龄 29 ± 4 岁；体重 83 ± 11 kg；身高 186 ± 9 cm；VO₂peak 49 ± 7 mL·min⁻¹·kg⁻¹）。纳入标准为年龄 18–40 岁、BMI 18–27 的男性（表 1）。受试者通过医学检查、12 导联心电图以及肘前静脉采血进行筛查。排除标准为过去 5 年内吸烟或使用其他尼古丁产品、规律用药或存在慢性疾病。本研究经哥本哈根首都大区伦理委员会批准（H-21068447），并遵循《赫尔辛基宣言》指南实施。所有受试者在入组前均获得口头和书面知情同意。

峰值摄氧量评估与实验日流程

实验日前至少 48 h，受试者在自行车功率计上进行递增负荷运动测试，以测定峰值摄氧量（V̇O₂Peak）。实验日，要求受试者在筛查和实验日前 24 h 避免摄入咖啡因、饮酒和运动。局部麻醉后，在运动腿的股动脉和股静脉放置导管（20 gauge；Arrow International；Reading，PA，USA）用于采血，并从非运动腿的股外侧肌获取肌肉活检样本。此外，将 3 根微透析探针（CMA Microdialysis AB）插入股外侧肌，用于间质液采样。首先进行 10 min、10 W 运动，以尽量减少插入创伤引起的组织反应并提高可重复性。随后受试者再休息 90 min，然后收集透析液样本。采集静息样本后，进行急性运动，包括 3 组单腿膝伸肌运动，负荷分别为 10、20 和 10 W，每个强度持续 20 min。在静息状态和每次运动期间收集动静脉血样和微透析液。运动终止后 2 h，按照既往所述获取肌肉活检样本³⁰˒³¹。

微透析程序

为评估 MOTS-c 是否随运动在骨骼肌间质液中升高，研究者对 8 份储存的完全匿名骨骼肌微透析样本进行了测定，这些样本来自年龄 18–40 岁的健康男性。微透析样本不含细胞，因此无法进行遗传筛查。透析液在静息状态以及中等至高强度单腿膝伸肌运动期间收集，所用纵向微透析探针由半透膜构成，孔径为 960 kDa，内径/外径为 0.34/0.44 mm（Asahi Medical，Tokyo，Japan），方法如既往所述³²。探针插入大腿肌肉（股外侧肌）。

原代骨骼肌细胞分离与 AICAR 干预

从静息活检样本中获得约 250 mg［125–425 mg］骨骼肌（股外侧肌）。将分离得到的原代人肌细胞以 20 × 10⁴ 个细胞的浓度接种于 35 mm 培养皿中，培养皿预先涂覆 1% 不含 phenol red 的 Matrigel（Sigma-Aldrich），并加入原代生长培养基（PGM）³⁰˒³¹˒³³，于 37 ℃、8% CO₂ 条件下孵育。1 天后，部分 PGM 被融合培养基替换（DMEM，补充 10% HS、20 mM glucose 和 200 nM L-glutamine），以促进分化。在融合培养基中培养 1 天后，肌管在含 0.1% BSA 的培养基中进行 8 h 血清饥饿处理，随后用于实验。之后，将饥饿培养基替换为 PGM（对照细胞）或含 0.5 mM AICAR 的 PGM，处理 2 天后用 Trizol（Thermo fisher Scientific）收获细胞。这些体外实验用于研究 AMPK 介导的人骨骼肌细胞中 MOTS-c 和 PGC-1α 调控的可能性。所有培养和实验过程中均使用无 phenol red 培养基，以避免对分析和干预代谢结果产生干扰。

统计学

结果以均值 ± SE 表示，并纳入数据点。采用双因素方差分析（ANOVA）。若总体效应显著，则采用 Student Newman-Keuls 事后检验定位差异。分别采用 Shapiro–Wilk 和 Brown–Forsythe 检验评估数据正态分布和方差齐性。若某一数据集不满足 ANOVA 对方差齐性的前提条件，则对数据进行 log₁₀ 转换。对于比较两组的数据，采用 t 检验。统计分析使用 SigmaPlot 15.0（Systat，San Jose，CA）完成，图形使用 GraphPad Prism 10.4（GraphPad Software，San Diego，CA）制作。当 p < 0.05 时，认为结果具有统计学意义。

Results

研究结果

骨骼肌中运动诱导 MOTS-c 而非 mRNA 调控部分受 PGC-1α 调节

在单次 1 h 跑台运动恢复 2 h 后，从诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（iMKO）小鼠及同窝对照（CTRL）小鼠中获取股四头肌。CTRL 小鼠骨骼肌中的 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA 均升高，而 PGC-1α iMKO 小鼠中 PGC-1α mRNA 的升高被抑制，但 MOTS-c mRNA 的升高未被抑制（图 1A 和 B），表明骨骼肌中基础状态及运动诱导的 MOTS-c mRNA 水平并不依赖于 PGC-1α。相应地，进行 5 周自愿跑轮运动的 CTRL 和 PGC-1α iMKO 小鼠在 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA 方面表现出相似反应，提示运动训练诱导的 MOTS-c 转录调控不依赖于 PGC-1α（图 1C 和 D）。同样，骨骼肌 MOTS-c 蛋白随运动训练而增加，且两种基因型均出现升高，但 PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌中的 MOTS-c 蛋白低于 CTRL 小鼠，提示 MOTS-c 蛋白水平依赖于 PGC-1α 的存在（图 1E）。即便如此，对运动训练小鼠血浆的分析显示，训练或骨骼肌 PGC-1α 均不影响循环 MOTS-c 蛋白水平（图 1F）。

图1. A）PGC-1α mRNA 含量和 B）MOTS-c mRNA 含量，来自诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（iMKO）小鼠及同窝 lox 对照（CTRL）小鼠在静息状态和单次跑台运动后 2 h 的股四头肌样本（acute ex）；n = 9–10。C）PGC-1α mRNA 含量，D）MOTS-c mRNA 含量，E）股四头肌样本中 MOTS-c 蛋白含量，以及 F）未训练（sedentary）和运动训练（trained）的同窝 PGC-1α iMKO 与 CTRL 小鼠血浆中的 MOTS-c 浓度；n = 8–10。数值以均值 ± SE 表示。mRNA 和蛋白含量以任意单位（AU）表示。*：与相同基因型内 saline 组相比差异显著，P < 0.05；#：与相同条件下 CTRL 小鼠相比差异显著，P < 0.05。

重复 MOTS-c 处理不影响 MOTS-c 和 PGC-1α mRNA 及蛋白调控

已有报道称，小鼠注射 MOTS-c 可增加 AMPK 磷酸化³˒⁶˒³⁴，细胞培养研究也提示 MOTS-c 与 PGC-1α 之间存在联系⁵˒⁶。为阐明 PGC-1α 是否是 MOTS-c 介导 AMPK 激活以及 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA 调控所必需的，本研究向 CTRL 和 PGC-1α iMKO 小鼠腹腔注射高剂量重组 MOTS-c（5 mg/kg 体重）。急性 MOTS-c 给药未在 CTRL 或 PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌中进一步影响 PGC-1α mRNA、MOTS-c mRNA 或 AMPK 磷酸化，尽管观察到轻微的总体基因型效应（图 2A、B、C、D）。同样，重复注射重组 MOTS-c（每周 5 次，持续 4 周）并未明显增加 PGC-1α mRNA、MOTS-c mRNA 或内源性 MOTS-c 蛋白（图 2E、F、G、I）。然而，与基础状态和运动训练状态（图 1F）相似，PGC-1α iMKO 小鼠表现出正常的骨骼肌 MOTS-c mRNA 水平，但无论是否处理，其 MOTS-c 蛋白均较低（图 2F、G、I）。值得注意的是，重复 MOTS-c 注射仅在 PGC-1α iMKO 小鼠中增加了骨骼肌 AMPK 磷酸化（图 2H）。代表性免疫印迹结果见图 2I。能量感应激酶 AMPK 众所周知可被急性运动激活¹⁶，并参与启动运动适应性转录反应³⁵。因此，将原代人肌细胞与 AMP 类似物 AICAR 孵育，以明确 AMPK 是否可在人肌细胞中同时诱导 PGC-1α 和 MOTS-c。AICAR 处理增加了 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA，提示单独激活 AMPK 足以在人肌细胞中诱导这两个靶标（图 2J 和 K）。

图2. A）PGC-1α mRNA 含量，B）MOTS-c mRNA 含量，C）AMPKThr172 磷酸化（phos），来自诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（PGC-1α iMKO）小鼠及同窝 lox 对照（CTRL）小鼠单次注射 saline 或 MOTS-c 后 3 h 的股四头肌样本；n = 9–10。D）代表性 western blot；E）PGC-1α mRNA 含量，F）MOTS-c mRNA 含量，G）MOTS-c 蛋白含量，以及 H）AMPKThr172 磷酸化，来自 PGC-1α iMKO 和 LOX CTRL 小鼠接受 saline 或 MOTS-c 重复注射 4 周后的股四头肌样本；n = 10–11。I）代表性 western blot。J）PGC-1α mRNA 含量和 K）MOTS-c mRNA 含量，来自用 PGM 或 PGM 加 AICAR 处理 48 h 的人肌细胞。数值以均值 ± SE 表示。*：与 CON 相比差异显著，且与相同基因型内 saline 组相比差异显著，P < 0.05；#：与相同条件下 CTRL 小鼠相比差异显著，P < 0.05。

MOTS-c 以 PGC-1α 依赖性方式增强线粒体生物能能力

通过对股四头肌肌纤维束进行高分辨率呼吸测定，评估 MOTS-c 处理对功能性生物能能力的影响。MOTS-c 处理增加了 CTRL 小鼠肌纤维束中偶联状态下亚最大 OXPHOS Complex I 驱动呼吸、最大 Complex I + II 驱动呼吸，以及 Complex I 驱动的 LEAK 呼吸，但在 PGC-1α iMKO 小鼠中未见上述变化（图 3A、B、C）。外源性加入 cytochrome c 作为样本内线粒体质量的指标，结果见图 3D。Citrate synthase 活性常被用作线粒体体积的标志物，该指标不受 MOTS-c 处理影响，但 PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌中的 citrate synthase 活性低于 CTRL 小鼠（图 3E）。将 Complex I 驱动呼吸除以 citrate synthase 活性后发现，该指标也仅在 CTRL 小鼠中随 MOTS-c 处理而升高，提示 MOTS-c 以 PGC-1α 依赖性方式增加了线粒体内在呼吸能力³⁶˒³⁷（图 3F）。

在 MOTS-c 处理的 CTRL 小鼠骨骼肌样本中，相对于呼吸活性的 ROS 释放降低，而在 PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌中未见降低（图 3G）。为评估 MOTS-c 诱导 ROS 调控变化的功能后果，本研究测定了骨骼肌蛋白羰基化水平，结果显示 MOTS-c 给药可降低蛋白羰基化，且该作用不依赖于基因型（图 3H）。MOTS-c 处理以 PGC-1α 依赖性方式改变了 ADP Michaelis-Menten 动力学（图 3I）。由于 PGC-1α iMKO 小鼠的表观 Vmax 低于 CTRL 小鼠（图 3J），因此按照常规将 Km 相对于 Vmax 进行计算，结果显示 MOTS-c 处理降低了 CTRL 小鼠中的 Km/Vmax（图 3K）。与此一致，Vmax 而非 Km/Vmax 与 ADP/ATP translocase 1（ANT1）的蛋白含量变化相一致（图 3L），ANT1 是线粒体内 ADP 可用性的潜在限制因子。

图3. A）亚最大 Complex I 刺激的 LEAK 线粒体呼吸（O₂ 通量），B）亚最大 Complex I 刺激的 OXPHOS 线粒体 O₂ 通量，C）最大 Complex I + Complex II 刺激的 OXPHOS O₂ 通量，D）线粒体质量控制，以相对于最大呼吸的 cytochrome c 分数反应表示，E）CS 活性，F）内在线粒体呼吸，即每单位线粒体体积的呼吸，以 O₂ 通量/CS 活性表示，G）经 O₂ 通量标准化的 H₂O₂ 释放，H）骨骼肌蛋白羰基化，I）线粒体 ADP 敏感性：O₂ 通量作为 ADP 浓度的函数，并拟合 Michaelis-Menten 动力学，J）推导得到的 Vmax，K）Km/Vmax，以及 L）ANT1 ADP/ATP translocase 蛋白含量，来自诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（PGC-1α iMKO）小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠接受 saline 或 MOTS-c 重复注射 4 周后的股四头肌。数值以均值 ± SE 表示。n = 9–11。I）代表性 western blot。蛋白含量以任意单位（AU）表示。*：与相同基因型内 saline 组相比差异显著，P < 0.05；#：与相同处理内 CTRL 小鼠相比差异显著，P < 0.05。

AMPK 表达是 MOTS-c 诱导生物能能力增加的部分必要条件

既往研究提示，MOTS-c 可增加 AMPK 活性¹⁹˒³⁸，且 AMPK 调控 PGC-1α³⁹。这提示 MOTS-c 诱导的、依赖于 PGC-1α 的呼吸能力增强可能通过 AMPK 介导。为验证这一假设，本研究在重复 MOTS-c 注射 4 周后，对诱导型肌肉特异性 AMPKα1/2 双敲除（AMPK iMDKO）小鼠的股四头肌组织进行分析。催化性 AMPK 亚基敲除得到验证（图 S2A、B、C）；并且与其他干预结果相似（图 2C–H），MOTS-c 处理未增加 CTRL 小鼠骨骼肌中的 AMPK 磷酸化（图 S2C）。MOTS-c 处理使骨骼肌 PGC-1α mRNA 升高，且该作用不依赖于 AMPK；而 MOTS-c mRNA 仅在 CTRL 小鼠中随 MOTS-c 处理而增加，但未观察到骨骼肌 MOTS-c 蛋白的变化（图 S2D、E、F）。代表性免疫印迹结果见图 S2G。

在 CTRL 小鼠肌纤维束中，Complex I 驱动的 LEAK 呼吸和最大 Complex I + II 驱动的 OXPHOS 呼吸均随 MOTS-c 处理而增加，而 AMPK iMDKO 肌纤维束中 MOTS-c 刺激的 OXPHOS 呼吸增加被抑制。此外，MOTS-c 处理有增加 CTRL 小鼠偶联状态下亚最大 Complex I 驱动 OXPHOS 呼吸的趋势（P = 0.084）（图 4A、B、C）。外源性加入 cytochrome c 作为样本内线粒体质量的指标，结果见图 4D。骨骼肌 citrate synthase 活性不受 MOTS-c 处理或 AMPKα1 和 α2 缺失的影响（图 4E）。相对于呼吸活性的 ROS 释放在 CTRL 小鼠骨骼肌中随 MOTS-c 处理而降低，但在 AMPK iMDKO 骨骼肌中未见降低（图 4F）。ADP Michaelis-Menten 动力学因 AMPK 缺失而出现轻微改变（图 4G）。因此，在生理盐水处理小鼠中，AMPK iMDKO 小鼠的表观 Vmax 低于 CTRL 小鼠（图 4H）；而相对于 Vmax 的 Km 在 CTRL 或 AMPK iMDKO 骨骼肌中均未随 MOTS-c 处理发生显著变化，但在 MOTS-c 处理小鼠中，AMPK iMDKO 小鼠的 Km/Vmax 高于 CTRL 小鼠（图 4I）。骨骼肌 ANT1 蛋白含量未观察到处理或基因型差异（图 4J）。

图4. A）亚最大 Complex I 刺激的 LEAK 线粒体呼吸（O₂ 通量），B）亚最大 Complex I 刺激的 OXPHOS 线粒体 O₂ 通量，C）最大 Complex I + Complex II 刺激的 OXPHOS O₂ 通量，D）线粒体质量控制，以相对于最大呼吸的 cytochrome c 分数反应表示，E）CS 活性，F）内在线粒体 O₂ 通量（通量/CS），G）经 O₂ 通量标准化的 H₂O₂ 释放，H）拟合 Michaelis-Menten 动力学的线粒体 ADP 敏感性，I）推导得到的 Vmax，J）Km/Vmax，以及 K）ANT1 ADP/ATP translocase 蛋白含量，来自诱导型肌肉特异性 AMPKα1/α2 双敲除（AMPK iMDKO）小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠接受 saline 或 MOTS-c 重复注射 4 周后的股四头肌样本。数值以均值 ± SE 表示；n = 9–11；ANT1 蛋白含量以任意单位（AU）表示；*：与相同基因型内 saline 组相比差异显著，P < 0.05；#：与相同处理内 CTRL 小鼠相比差异显著，P < 0.05。

MOTS-c 驱动的线粒体改善似乎不依赖于线粒体蛋白含量，且不影响底物利用、热量摄入或身体成分

本研究分析了小鼠骨骼肌线粒体含量和能力，以评估 MOTS-c 驱动线粒体功能变化的机制，以及 PGC-1α 在这些变化中的作用。在任一基因型当中，生理盐水和 MOTS-c 处理小鼠之间股四头肌 OXPHOS Complex I、II、III、IV 或 V 蛋白含量以及 PDH-E1α 蛋白含量均未发生变化。在生理盐水和 MOTS-c 处理条件下，PGC-1α iMKO 小鼠股四头肌中的 OXPHOS 和 PDH-E1α 蛋白含量均低于 CTRL 小鼠（图 5A 和 B）。本研究检测骨骼肌 UCP3 蛋白含量作为肌肉解偶联能力指标，结果显示基因型与处理之间存在总体交互作用，并且在 MOTS-c 处理条件下，CTRL 小鼠 UCP3 蛋白含量有高于 PGC-1α iMKO 小鼠的趋势（图 5C）。既往报道称，PGC-1α 和 MOTS-c 均参与抗氧化成分的调控¹¹˒²¹˒⁴⁰。MOTS-c 处理未改变肌肉抗氧化蛋白 superoxide dismutase 2（SOD2）和 catalase 的蛋白含量，但在生理盐水和 MOTS-c 处理条件下，PGC-1α iMKO 小鼠 SOD2 蛋白含量均低于 CTRL 小鼠（图 5D 和 E）。

观察到的呼吸效率效应可能归因于 MOTS-c 处理引起的线粒体膜形态变化。因此，本研究测定了内膜调节因子 OPA1、mitofilin 以及融合蛋白 MFN2 的含量。MOTS-c 处理未改变骨骼肌 OPA1 或 mitofilin 蛋白含量。然而，在生理盐水和 MOTS-c 处理条件下，PGC-1α iMKO 小鼠股四头肌 OPA1 和 mitofilin 蛋白含量均低于 CTRL 小鼠（图 5F、G、H）。代表性免疫印迹结果见图 5I。

既往研究报道，小鼠重复注射 MOTS-c 可增加产热³˒²⁵，降低体重和摄食量，并增加瘦体重⁴，提示其可通过线粒体解偶联增加能量消耗。因此，本研究在重复 MOTS-c 和生理盐水处理后，对小鼠进行 MRI 扫描和代谢笼检测，以评估其对身体成分和全身代谢的影响。MOTS-c 给药未引起动物呼吸交换率（RER）、O₂ 消耗或身体活动的变化（图 S1A 和 B）。与 CTRL 小鼠相比，PGC-1α iMKO 小鼠在黑暗期 O₂ 摄取略高，并在黑暗期后期表现出较低 RER（图 5J、K、L）。生理盐水和 MOTS-c 处理的 CTRL 小鼠之间体重和身体成分相似，这与既往观察结果一致³˒⁴。在任一基因型中，生理盐水和 MOTS-c 处理小鼠之间摄食量和体重均未观察到差异，这可能提示小鼠具有相似的基础代谢率和觅食行为。骨骼肌中缺乏 PGC-1α 表达总体上不影响体重或身体成分，这与既往 PGC-1α 研究结果一致²³˒⁴¹˒⁴²（图 S1C、D、E、F）。

图5. A）OXPHOS 蛋白含量，分别显示 Complex I、II、III、IV 和 V，B）PDH-E1α 蛋白含量，C）UCP3 蛋白含量，D）SOD2 蛋白含量，E）Catalase，F）OPA1 蛋白含量，G）Mitofilin 蛋白含量，以及 H）MFN2 蛋白含量，来自诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（PGC-1α iMKO）小鼠及同窝 LOX 对照（CTRL）小鼠接受 saline 或 MOTS-c 重复注射 4 周后的股四头肌；I）代表性 western blot。J）24 h 过程中的呼吸交换率（RER）（12 h 光照/12 h 黑暗），K）PGC-1α iMKO 和同窝 LOX CTRL 小鼠接受 saline 或 MOTS-c 重复注射 4 周后光照期的氧耗量（VO₂），L）黑暗期的 VO₂。蛋白含量以任意单位（AU）表示。数值以均值 ± SE 表示；A–H 为 n = 9–11，J–L 为 n = 6–11；*：与相同基因型内 saline 组相比差异显著，P < 0.05；#：与相同条件下 CTRL 小鼠相比差异显著，P < 0.05。

重复 MOTS-c 处理通过 PGC-1α 调控线粒体相关基因表达

本研究对接受生理盐水或 MOTS-c 处理 4 周的 CTRL 和 PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌样本进行 RNA-seq。主成分分析显示，相对于 CTRL 生理盐水处理小鼠，CTRL MOTS-c 处理小鼠存在明显差异性的基因调控（采用 Canberra 距离的多维尺度分析［MDS］进行可视化，见图 6A）。尽管 PGC-1α iMKO 组与 CTRL 组明显不同，但 iMKO MOTS-c 处理小鼠与 iMKO 生理盐水处理小鼠之间未观察到这种处理效应，提示 PGC-1α 是 MOTS-c 驱动基因表达所必需的前提条件。

为确定与线粒体蛋白网络中潜在 MOTS-c 处理效应相关的基因簇，本研究对 CTRL MOTS-c 与 PGC-1α iMKO MOTS-c 之间的基因命中结果进行评估和排序。为避免假阳性发现，在进一步分析前，从 MOTS-c 数据集中筛除并丢弃了 CTRL 生理盐水与 PGC-1α iMKO 生理盐水之间由基础基因型驱动的命中结果。基因评分分析显示，CTRL 生理盐水与 PGC-1α iMKO 生理盐水之间有 161 个差异上调基因和 30 个差异下调基因；而 CTRL MOTS-c 与 PGC-1α iMKO MOTS-c 经过排序后显示有 259 个上调基因和 64 个下调基因。在这些命中结果中，CTRL MOTS-c 与 PGC-1α iMKO MOTS-c 组中分别有 135 个和 48 个差异上调和下调基因。上调基因列于图 S3B。利用 Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis 蛋白网络（STRING network）核心数据资源，本研究聚焦于信息学数据库中的 135 个显著上调基因，对潜在直接和间接关联进行计算评估（图 S3A）。Biological Process（gene ontology）富集分析显示，大量注释与 oxidative phosphorylation、有氧呼吸、呼吸电子传递链和线粒体生理相关（图 6B）。Reactome Pathways 富集分析中的注释显示，最强关联集中于呼吸电子传递和 TCA 循环组分（图 6C）；而 Subcellular Localization（COMPARTMENTS）富集分析显示，最强关联集中于线粒体内膜过程（图 6D）。总体而言，这些线粒体靶向通路提示，MOTS-c 驱动的效应涉及线粒体呼吸能力和线粒体结构。

图6. A）采用 Canberra 距离的多维尺度分析（MDS）进行的主成分分析；B）功能富集可视化，显示 Biological Processes Ontology 中的错误发现率（FDR）和基因计数；C）Reactome Pathway Enrichment；D）Subcellular Localization enrichment（COMPARTMENTS）数据库，样本来自诱导型肌肉特异性 PGC-1α 敲除（iMKO）小鼠及同窝 lox 对照（CTRL）小鼠接受 saline 或 MOTS-c 重复注射 4 周后的股四头肌；n = 7–9。

骨骼肌 MOTS-c 出现在间质中，但在人体中等强度运动期间未观察到其由骨骼肌释放至循环

本研究开展并分析了人体运动干预，以阐明运动诱导的骨骼肌 PGC-1α 和 MOTS-c 调控。60 min 单腿膝伸肌运动在人骨骼肌中诱导了 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA 的相似升高（图 7A 和 B）。既往研究曾提出 MOTS-c 蛋白可能由骨骼肌释放至血液⁴˒⁴³，但本研究未检测到从静息到运动过程中 MOTS-c 的动脉、静脉或动静脉浓度差发生变化（图 7C、D、E）。因此，这些观察结果不支持收缩骨骼肌是循环中骨骼肌 MOTS-c 的主要来源。在本人体实验中，所用 100 kDa 微透析探针被发现不能允许 MOTS-c 通过，这一现象也常见于 cytokines 等化合物。随后通过含 MOTS-c 缓冲液浴的体外实验也验证了其不能通过。然而，在另一项既往健康年轻男性研究中使用的另一类型微透析探针所获得的透析液中，可以检测到 MOTS-c，并发现其从静息到与本研究强度相似的膝伸肌运动过程中升高，提示 MOTS-c 在骨骼肌收缩期间释放，并可能具有自分泌和旁分泌作用（图 7F）。

图7. 年轻健康男性受试者在静息状态以及急性单腿中等强度运动期间/之后的数据。A）人骨骼肌在静息状态（Rest）和运动后 2 h（Acute ex）的 PGC-1α mRNA 含量，B）MOTS-c mRNA 含量；n = 5–6。C）MOTS-c 的血浆动脉浓度；D）MOTS-c 的血浆静脉浓度；E）静息状态和运动期间 MOTS-c 的血浆静脉-动脉（v–a）浓度差（diff.）。负的 v–a 值表示肌肉摄取。F）静息状态和中等强度运动（Acute ex.）期间骨骼肌间质 MOTS-c 水平。数值以均值 ± SE 表示，n = 7–8。*：与 Rest 相比差异显著，P < 0.05。

Discussion

讨论

本研究的主要发现是，4 周 MOTS-c 处理增加了骨骼肌（SkM）非偶联呼吸、亚最大和最大 ADP 刺激呼吸以及 ADP 敏感性，并以依赖骨骼肌 PGC-1α 的方式降低 ROS 释放。在缺乏催化性 AMPKα1 和 α2 亚基的骨骼肌中，也观察到几乎相同的生物能学效应。综合来看，这些发现表明，MOTS-c 驱动的线粒体呼吸能力增强需要完整的 AMPK/PGC-1α 调控通路参与。MOTS-c 诱导的呼吸能力增加似乎属于内在性或质量性变化，即“每个线粒体”层面的改善，而不是由与生物能功能相关的线粒体蛋白大量增加所驱动。然而，RNA-seq 分析预测，MOTS-c 介导的呼吸增强是通过一系列线粒体 REDOX 处理、结构和酶促系统的转录变化实现的，这些变化共同促进线粒体功能改善。此外，人体急性运动增加了骨骼肌间质 MOTS-c 浓度，但未改变 MOTS-c 的动静脉差值。

既往研究观察到，MOTS-c 处理可在存在 palmitate 的条件下增加 C2C12 细胞耗氧率⁴，并增加衰老成纤维细胞的细胞耗氧量⁴⁴，提示其增强脂质利用能力。相反，过表达 MOTS-c 的 HEK293 细胞表现出全细胞耗氧率降低³，因此关于 MOTS-c 是否调节呼吸能力的证据仍不一致。然而，与本研究 RNA-seq 结果显示 MOTS-c 可诱导调控编码线粒体呼吸相关蛋白的基因相一致，本研究首次证明 MOTS-c 可增强小鼠骨骼肌的呼吸能力。这一效应表现为最大 LEAK 和 OXPHOS 呼吸以及 ADP 动力学均发生改善。此外，线粒体变化在 citrate synthase 活性未发生改变的情况下出现，而 citrate synthase 活性常被用作肌肉中线粒体体积的标志物³⁶˒⁴⁵，这提示观察到的线粒体呼吸变化应归因于线粒体功能的内在质量性增强。同时，H₂O₂ 释放降低作为 ROS 生成的指标，进一步支持在 MOTS-c 处理后，抗氧化防御含量未增加的情况下，线粒体质量得到改善。MOTS-c 处理组蛋白羰基残基水平低于 CTRL 小鼠，这一结果进一步得到印证，蛋白羰基残基是 ROS 相关蛋白损伤降低的标志。这表明 MOTS-c 可在减轻骨骼肌 ROS 诱导损伤方面发挥有益作用。值得注意的是，这些 MOTS-c 介导的线粒体功能效应总体上在两个不同小鼠品系开展的两个独立实验中均得到证实。

高分辨率呼吸测定数据显示，MOTS-c 介导的线粒体呼吸和 H₂O₂ 释放效应在很大程度上依赖于 PGC-1α。同样，在小鼠骨骼肌缺乏 AMPK 催化亚基的情况下，大多数 MOTS-c 诱导的呼吸效应被消除，证实 MOTS-c 驱动的线粒体内在效应依赖于 AMPK/PGC-1α 调控轴。此外，MOTS-c 介导的 ROS 释放效应见于 lox 小鼠，而未见于 PGC-1α iMKO 小鼠；但 MOTS-c 处理后骨骼肌蛋白羰基化的降低不依赖于 PGC-1α。这提示 PGC-1α 并不是 MOTS-c 调控小鼠骨骼肌蛋白损伤所必需的因素。重复 MOTS-c 注射可不依赖 PGC-1α 降低肌肉蛋白羰基化，而肌肉 ROS 释放的降低则需要 PGC-1α，这一发现与我们既往研究结果一致，即尽管运动训练对抗氧化蛋白的作用依赖于 PGC-1α，但其降低肌肉蛋白羰基化的作用并不依赖于 PGC-1α⁴⁶。综合来看，这可能提示线粒体 ROS 生成对全肌蛋白羰基化的影响依赖于多种抗氧化机制，和/或细胞质 ROS 生成可导致不依赖于 PGC-1α 的全肌蛋白氧化。

已有研究提出，nuclear factor erythroid 2-related factor 2（NRF2）与 PGC-1α 之间存在调控环路⁴⁷。尽管其下游靶标 SOD2 和 catalase 的含量未发生改变，但并不能排除 MOTS-c 激活 NRF2 的可能性；如既往报道²¹，NRF2 可能以较为微妙的方式参与观察到的 REDOX 处理改善和 ROS 相关蛋白损伤降低。

也可以推测，MOTS-c 对线粒体的部分驱动效应可能与翻译后修饰或动态复合体相互作用有关，例如 respirasomes 或变构性催化酶活性改善。已有报道称，MOTS-c 给药或孵育可直接激活代谢信号通路中的其他相关蛋白靶标，如 casein kinase 2（CK2）和 mammalian target of rapamycin（mTOR），这些蛋白可能对肌肉健康和线粒体功能产生叠加作用⁴⁸˒⁴⁹。CK2 已被确定为 MOTS-c 的结合伴侣，可促进肌肉功能和健康。然而，CK2 也被认为是 PGC-1α 和质子泄漏的负性调控因子⁵⁰，这似乎与本研究观察到的 MOTS-c 诱导 LEAK 增加相矛盾。此外，CK2 和 mTOR 均作为肌肉结构与生长的调控因子发挥作用，尽管 MOTS-c 给药并未显示净肌肉生长，但这些通路完全有可能参与本研究中对肌肉健康和线粒体功能的叠加效应。

本研究开展人体运动实验，以阐明运动诱导的骨骼肌 PGC-1α 和 MOTS-c 调控。本研究观察到，60 min 间歇性单腿膝伸肌运动可在人骨骼肌中诱导 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA 相似升高，这与既往观察结果一致⁴˒¹³。AICAR 诱导的人肌细胞 AMPK 激活导致 PGC-1α 和 MOTS-c mRNA 升高，支持单独激活 AMPK 即足以诱导 PGC-1α 和 MOTS-c 的双重转录。另一方面，本研究发现，无论是在缺乏训练、运动训练还是急性运动状态下，CTRL 和 PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌 MOTS-c mRNA 含量均相似，这与既往在 C2C12 肌管中报道的 PGC-1α 敲低和过表达分别降低和增加 MOTS-c mRNA 含量的研究结果相反⁵˒⁶。本研究结果提示，PGC-1α 可能调控的是 MOTS-c 的翻译和/或降解过程，而非小鼠骨骼肌中 MOTS-c 的转录。相应地，PGC-1α 已被证明可部分通过抑制 forkhead box O3（FoxO3）的转录活性，降低参与蛋白降解的关键 atrogenes 的转录⁵¹。此外，在缺乏训练和运动训练小鼠中，PGC-1α iMKO 小鼠骨骼肌 MOTS-c 蛋白含量均低于 CTRL 小鼠，这与既往研究一致，即 PGC-1α 敲低会下调 MOTS-c 蛋白含量，而 PGC-1α 过表达会增加 C2C12 肌管中的 MOTS-c 蛋白含量⁵˒⁶。这表明 PGC-1α 调控骨骼肌基础 MOTS-c 蛋白水平，并且该调控不依赖于训练状态。

既往研究提示，急性运动和运动训练均可增加循环 MOTS-c 水平，但关于运动诱导循环 MOTS-c 升高的证据仍存在矛盾。本研究发现，尽管 CTRL 小鼠肌肉 MOTS-c mRNA 和蛋白均升高，但运动训练并未增加 MOTS-c 血浆浓度，这与既往小鼠训练研究结果相反⁵˒⁶。与本研究一致，既往一项人体研究报道，中等强度急性运动后循环 MOTS-c 水平未发生变化⁷。另一方面，也有研究观察到，单次运动后人骨骼肌和血浆中 MOTS-c 升高⁴，血浆 MOTS-c 运动反应差异可能源于运动类型和强度不同。本研究使用的单腿膝伸肌模型更为理想，因为它能够观察运动的局部效应，而不是涉及许多其他因素的系统性效应，同时还能够评估动静脉差异。为阐明骨骼肌是否在运动过程中向循环释放 MOTS-c，本研究测定了单腿运动期间的动静脉浓度差。然而，该运动并未诱导 MOTS-c 蛋白浓度动静脉差值增加，提示该运动方案并未导致运动过程中 MOTS-c 的净释放。相反，尽管总体上未达到显著性，7 名受试者中有 6 名表现出 MOTS-c 向肌肉组织摄取的数值性增加。人体受试者中未观察到 MOTS-c 释放，这一结果也得到小鼠实验的支持：尽管骨骼肌 MOTS-c 蛋白含量降低，但小鼠骨骼肌 PGC-1α 敲除并未影响血浆 MOTS-c 浓度。总体而言，这些发现并未提供证据支持循环 MOTS-c 来源于骨骼肌。然而，不能排除其他运动形式，包括更高强度或更长时间运动，可能诱发这种反应。此外，需要强调的是，未观察到负向动静脉 MOTS-c 差值并不能排除 MOTS-c 由骨骼肌细胞局部释放并同时产生旁分泌和/或自分泌效应的可能性。与此一致，本研究观察到运动期间微透析液中 MOTS-c 蛋白增加，提示急性运动增加了间质 MOTS-c 浓度，并支持 MOTS-c 可能在运动反应中对骨骼肌发挥自分泌和/或旁分泌调控作用。

为评估小鼠骨骼肌中 MOTS-c 驱动的基因调控变化，并解释观察到的 MOTS-c 对骨骼肌线粒体功能的影响，本研究采用 RNA-seq。RNA-seq 数据显示，MOTS-c 诱导 135 个基因上调，这些基因主要编码与线粒体过程相关的蛋白，涉及结构富集（Lonp1、Apoo、Chchd3）、抗氧化防御（Txn2）、电子传递（mt-Co1、Higd2a、Taco1、Cmc2、Coa7）、TCA 循环（Bckdha、Dld、Ogdh）、酶活性修饰因子（Phd2、SIRT3）、脂肪酸转运（Slc25a20）和 β-氧化（Acadl、Acat1、Etfa）。值得注意的是，多个编码 NADH: ubiquinone oxidoreductase 亚基表达相关蛋白的基因被上调，该复合物属于 OXPHOS 电子传递系统中的 Complex I。尽管本研究中 Complex I 亚基 NDUFB8 蛋白含量并未因 MOTS-c 处理而上调，但亚基组成变化可能增强该复合体的稳定性和效率⁵²，并可能进一步促进 respirasome 形成。总体而言，观察到的多种线粒体蛋白 mRNA 含量变化提示，MOTS-c 介导线粒体功能复杂增强具有一定基础，并预测呼吸能力增加。由于 OXPHOS 复合体的形成和相互作用可能需要嵴曲率和表面积增加⁵³˒⁵⁴，因此可以认为，即使线粒体膜组成发生轻微变化，也可能催化功能性呼吸过程。然而，线粒体内膜组织蛋白 OPA1 和 mitochondrial contact site and cristae organizing system（MICOS）核心亚基 mitofilin 未表现出 MOTS-c 驱动的效应，因此并不支持这一作用。小鼠骨骼肌中 fission/fusion 蛋白 DRP1 和 MFN2 未随 MOTS-c 处理发生变化，这与既往研究中 MOTS-c 通过 MFN2 诱导调控脂肪细胞线粒体融合过程的结果不一致⁵⁵，也不支持 MOTS-c 介导的 fission/fusion 蛋白变化可解释观察到的线粒体呼吸效应。然而，我们既往已证明，线粒体网络结构与线粒体功能之间存在关联，这种关联由 PGC-1α 调控，且不依赖于线粒体含量变化²³˒⁴⁵。本研究 RNA-seq 数据显示，多个参与线粒体结构的因子在 CTRL 和 PGC-1α 肌肉中受到 MOTS-c 差异调控，这可能提示 MOTS-c 通过 PGC-1α 介导的线粒体网络结构作用调控线粒体内在功能。

鉴于既往认为 MOTS-c 可增强产热特性，而 PGC-1α 是多种组织中产热程序的强效转录驱动因子，因此合理推测 MOTS-c 发挥产热效应至少部分依赖于 PGC-1α。然而，MOTS-c 对骨骼肌 UCP3 和 ANT1 蛋白含量缺乏明确影响，因此并不支持观察到的呼吸解偶联增加，并可能提示其他解偶联因子参与其中。MOTS-c 处理在任一基因型中均不影响全身耗氧量，这一观察结果提示，由 MOTS-c 驱动的肌肉解偶联能力增加（线粒体 LEAK 呼吸）所导致的能量消耗增加不足以在全身水平被检测到，可能需要更强的代谢挑战，如寒冷暴露或高脂饮食，才能被充分揭示。同样，尽管 MOTS-c 在基础条件下可能不影响底物选择，但 MOTS-c 可能调节暴露于代谢应激小鼠的代谢灵活性。这些发现进一步支持这样一种观点，即 MOTS-c 处理获得的某些效应只有在细胞和/或小鼠暴露于不同代谢挑战条件下才会显现。

已发表文献中关于 MOTS-c 短暂激活 AMPK 的报道差异较大。MOTS-c 诱导的 AMPK 动态变化似乎高度依赖于模型、干预方式和给药模式。从逻辑上看，体内 MOTS-c 不应长期激活 AMPK，因为这在生理上并不合适。AMPK 应在细胞能量稳态重建后被短暂激活并随后失活，因为 AMPK 激活时也会抑制许多合成代谢通路。因此，本研究干预所选择的时间点未捕捉到 AMPK 的推测性阶段性激活是合理的。既往报道称，MOTS-c 主要靶向骨骼肌，并作用于参与 methionine-folate cycle 和 de novo purine synthesis 的酶。最初研究报道，MOTS-c 可耗竭 5-methyl-tetrahydrofolate，导致内源性中间产物 ZMP 积累，而 ZMP 是 AMPK 的强效激活剂³。有证据支持，通过药理学抑制 purine synthesis pathway 可诱导 ZMP 在小鼠 MC-7 细胞中充分积累并激活 AMPK⁵⁶，但这是否能在体内自然发生仍不清楚。在本研究中，无论基因型如何，单次或重复 MOTS-c 注射似乎均未诱导小鼠骨骼肌 AMPKThr172 磷酸化发生可检测变化。然而，AMPK 对 MOTS-c 在线粒体呼吸方面的作用具有部分必要性这一事实支持 MOTS-c 注射确实激活了 AMPK。这种 AMPK 激活很可能是间歇性的，并可能发生在处死前的时间点之前。

需要指出的是，由于给药方式的原因，本研究所用小鼠模型中究竟有多少重组 MOTS-c 实际到达肌细胞尚不明确。然而，既往研究⁴˒⁵⁷˒⁵⁸已显示 MOTS-c 处理对培养中的骨骼肌细胞具有显著功能效应，强烈支持其对这些细胞存在直接作用。此外，由于 MOTS-c 可能对所有器官产生代谢效应，因此部分器官间溢出效应也可能参与肌肉组织中观察到的效应。这可能会混淆对骨骼肌中 MOTS-c 直接和间接效应的解释。

总之，MOTS-c 处理以 AMPK/PGC-1α 依赖性方式对小鼠骨骼肌线粒体呼吸产生直接增强性生物能效应，且未明显影响线粒体含量。基于 RNA-seq 数据，这些效应似乎通过多个线粒体动态功能因子共同发挥作用，并可能为观察到的内在效应提供基础。此外，PGC-1α 是运动训练诱导小鼠骨骼肌 MOTS-c 蛋白增加所必需的因素。另外，在人体急性运动期间，MOTS-c 在间质中升高，但并未从运动肌肉释放至循环。综合来看，本研究为小鼠骨骼肌中 MOTS-c 以 PGC-1α/AMPK 依赖性方式调控线粒体功能提供了证据，并提示 MOTS-c 可能在人体肌肉对急性运动的反应中发挥自分泌和/或旁分泌作用。