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文章标题：壳寡糖及其相关衍生物对幽门螺旋杆菌的抑菌作用

期刊名称：《中国食品学报》

目次：2023.6 第23卷第6期

摘要采用打孔方法研究以壳寡糖为代表的益生元对于幽门螺旋杆菌的抑制作用。试验结果显示：不同浓度的壳聚糖、羧甲基壳聚糖未产生抑菌环。壳寡糖B（脱乙酰度为94%）在质量浓度为50mg/mL的条件下，所形成的抑菌环半径为（4.1±0.23）mm。在质量浓度为10mg/mL的阳性对照（甲硝唑）条件下，所形成的抑菌环半径为（5.5±0.15）mm。高脱乙酰度的壳寡糖B（50mg/mL）与幽门螺旋杆菌共培养后导致菌体生物积累量下降，而壳寡糖A（50mg/mL）对其生长无明显影响。质量浓度为50 mg/mL的高脱乙酰度壳寡糖B具有抑制幽门螺旋杆菌的作用，而壳寡糖A（脱乙酰度为80%）、壳聚糖和羧甲基壳聚糖不具有抑制幽门螺旋杆菌的作用。

关键词 壳寡糖；幽门螺旋杆菌；打孔法；甲硝唑；抑菌浓度

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp）寄生于肠道，是一种螺旋形、微厌氧革兰氏阴性菌。目前感染超过全球50%以上的人群，与多种胃肠道疾病及胃肠外疾病密切相关，如消化性溃疡、慢性胃炎及胃癌等，被归类为第1类致癌物[1-3]。

目前幽门螺旋杆菌的治疗方案包括伴同疗法、混合疗法、包含左氧氟沙星的方案[4]。频发的抗生素耐药性问题以及临床治愈后的复发率上升让人重新审视幽门螺旋杆菌的治疗方案。2010年全球幽门螺旋杆菌的复发率呈现地区化分布规律，复发率已达4.8%，高于1990年的3.9%。幽门螺旋杆菌对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率（包括多重耐药率）在2016年被发现呈直线上升趋势，其中克拉霉素为20%～50%，甲硝唑为40%～70%[5]。一线治疗方案如克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑以及质子泵抑制剂联用的治疗方案治愈率有所下滑，其最主要的原因在于克拉霉素的耐药性上升[6]。因此临床治疗中常常需要延长临床治疗周期，由此常带来多种胃肠道反应，如恶心、味觉障碍、消化不良、腹痛、腹泻。脑肠同轴理论中指出，胃肠动力受大脑的调节主要表现在两个方面，即神经传导和内分泌调节[7]。过度使用抗生素可能带来的胃肠功能紊乱，肠易激综合征（IBS）以及情绪问题，给人的正常生活带来严重负担。1

近年来出现的益生元、益生菌疗法可以很好地解决临床治愈率下降以及副作用等多重问题[8]。壳寡糖及其相关化合物是一种以甲壳纲动物为来源的优质益生元，具有出色的生物活性[9]。据ZHEN等[10]研究，壳聚糖对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具备抗菌活性, 以甲壳纲动物为原料的壳寡糖及其系列产物，被证明具有一定的抑菌效果。壳寡糖被列入我国新食品原料目录，拥有极大的市场应用前景[11]。目前国内外益生元抑制幽门螺旋杆菌的报道更多的集中在组合疗法，如抗生素与益生菌结合疗法[12-13]，还未见系统性的体外抗菌研究。本次研究中对比研究壳寡糖及其相关产物的体外抗幽效果，希望能够为后续临床抗幽门螺旋杆菌的新型疗法提供参考。

1 试验材料

1.1 试验用菌株

幽门螺旋杆菌，编号GDMCC1.1820，购自广东省微生物菌种保藏中心，采用冷冻干燥保藏管进行保存。

1.2 主要试剂与耗材

脑心浸液粉，OXOID；哥伦比亚琼脂，环凯微生物；无菌脱纤维羊血，南京茂捷微生物；真菌培养皿，BIOFIL；壳聚糖（脱乙酰度＞90%），羧甲基壳聚糖，壳寡糖 A，壳寡糖 B。

1.3 主要仪器设备

HL-B型厌氧工作站，LABIOPHY；HF100型三气培养箱，力康；STARTER3100型pH计，OHAUS。

2 试验方法

2.1 主要物料及溶液的制备

2.1.1 主要物料的制备

本次研究试验中所涉及的壳聚糖及壳寡糖、羧甲基壳聚糖均为自主研发制备而成，以阿拉斯加雪蟹壳为主要原料，通过“一步法”制备的高脱乙酰度壳聚糖，然后以反应工艺所获得的壳聚糖，通过复合生物酶法制备的不同脱乙酰度的壳寡糖，并以化学法制备获得的特定聚合度的羧甲基壳聚糖，将直接用于后续抑菌性试验研究。

2.1.2 主要溶液的配置

1）幽门螺旋杆菌培养基的配置：称取脑心浸液粉9.6g、哥伦比亚琼脂23.4g，加入蒸馏水780mL，100mL分装后高压灭菌15min，当温度降至46℃时每100mL加入5mL无菌脱纤维羊血，倒板待用。

2）不同浓度的壳聚糖溶液配置方法如下：壳聚糖溶液（10 mg/mL）：称取0.5g壳聚糖粉末，加入1%醋酸溶解，定容至50mL，测得pH值为4.08，使用0.22µm滤膜进行过滤除菌。5mg/mL壳聚糖和1mg/mL壳聚糖溶液以相应倍数进行稀释。壳聚糖溶液（20 mg/mL）：称取1g壳聚糖粉末，加入2%醋酸溶解，定容至50mL。

3）不同脱乙酰度壳寡糖原料，具体分类如下：

根据试验需求，分别取不同种类的壳寡糖原料，配置不同浓度梯度的壳寡糖原料，范围为1~50mg/mL，配置方法如下所示：

壳寡糖溶液（50mg/mL）：称取2.5g壳寡糖粉末，加入去离子水进行溶解，定容至50mL，使用0.22µm滤膜进行过滤除菌。

壳寡糖溶液（10mg/mL）：称取0.5g壳寡糖粉末，加入去离子水溶解，定容至50mL，测得pH值为5.45，使用0.22µm滤膜进行过滤除菌。5mg/mL壳寡糖和1mg/mL壳寡糖溶液以相应倍数进行稀释。

4）羧甲基壳聚糖溶液（10mg/mL）：称取0.5g羧甲基壳聚糖粉末，加入去离子水溶解，定容至50mL，测得pH值为9.65，使用0.22 µm滤膜进行过滤除菌。5mg/mL羧甲基壳聚糖和1mg/mL羧甲基壳聚糖溶液以相应倍数进行稀释。羧甲基壳聚糖溶液（20mg/mL）：称取 1g羧甲基壳聚糖粉末，加入去离子水溶解，定容至50mL。

5）甲硝唑溶液（10mg/mL）：称取0.2g甲硝唑，加入1%醋酸进行溶解，定容至20mL。

2.2 体外抑菌试验检测壳寡糖及其衍生物抑制幽门螺旋杆菌

根据周蓉等[15]改进的体外抑菌性研究方法，以2.1节中配置的溶液为试验组，研究在不同浓度下的壳寡糖、壳聚糖以及羧甲基壳聚糖的体外抗幽门螺旋杆菌的作用，阳性对照为甲硝唑溶液，阴性对照组为无菌 ddH2O或醋酸溶液，空白对照为不添加任何试液。以下是具体方案：

从-80℃冰箱取出保藏的Hp菌种，37℃水浴迅速解冻后，涂布于新鲜的平板上，37℃、5%O2、10%CO2培养48h。观察菌落形态为透明，灰白色，边缘平整湿润，革兰氏染色为阴性，挑取单菌落，纯化培养3代后，再进行48h培养后，从平板上刮取少量Hp，重悬于1mL无菌 ddH2O，根据 OD625的大小将菌悬液浓度控制在107CFU/mL。

将该浓度的菌悬液进行涂布试验，其中每个平板涂布100µL菌液，每个平板上打4个孔，每孔加入50µL待测药物，放入培养箱中以上述相同条件培养48h，观察并用游标卡尺测量抑菌环半径（mm），并拍照保存，阳性对照和阴性对照的处理方法同上。

2.3 壳寡糖及其相关产物对幽门螺旋杆菌体外生长的影响

以2.2节中验证获得具备体外抑菌作用的物料，甲硝唑等加入幽门螺旋杆菌进行共培养，控制初始幽门螺旋杆菌的浓度为107CFU/mL，观察幽门螺旋杆菌的生长情况，液体培养的发酵条件为事先摸索的幽门螺旋杆菌发酵培养基，摇瓶微需氧（6％O2、80％N2、10％CO2）的培养技术，置于恒温摇床中37℃振荡培养，以不添加任何其他溶液的培养基作为调零溶液，记录不同时间段的吸光度值OD625，运用 orgin2018绘制菌体生长曲线图，讨论壳寡糖对幽门螺旋杆菌生长的影响。

3 结果与分析

3.1 壳聚糖、羧甲基壳聚糖对幽门螺旋杆菌的抑菌作用研究

打孔法测定生物活性物质的抑菌性是药敏学中常用的方法，该方法需要所研究的物料在平板上扩散性较好，所以需要考察不同溶剂对于目标产物的溶解性，选择合适的溶剂和浓度作为载体，进行后续的抑菌性试验。

3.1.1 不同溶剂溶解壳聚糖、壳寡糖及羧甲基壳聚糖的效果

壳聚糖是一种在酸性条件下溶解性好的生物大分子多糖，常用的溶解溶剂包括无机酸和有机酸。选择不同种类的酸，配置成质量浓度20 mg/mL的壳聚糖溶液，观察溶液的溶解情况，试验结果如表2所示：壳聚糖溶液在无机酸中的溶解速度和效果优于有机酸，其中醋酸溶解速度快，所形成的溶液性质为透明均一的液体。

目前大多关于壳聚糖溶液的研究一般以充分溶解的低浓度壳聚糖溶液为研究对象，溶液多以醋酸稀溶液为主，质量分数为1%~2%。故后续选择质量分数为1%，2%的醋酸溶液作为溶剂，研究不同浓度下的壳聚糖的抑菌效果。由于壳寡糖、羧甲基壳聚糖极易溶于水，所以本次抑菌性试验所选择的溶剂为无菌ddH2O，羧甲基壳聚糖是一种由壳聚糖的羧甲基化衍生物，水溶性较好，其在水中的最大溶解度为20 mg/mL。

3.1.2 壳聚糖及羧甲基壳聚糖的抑菌效果情况

本研究中以醋酸溶液为溶剂，配置不同浓度的壳聚糖溶液，空白对照为1%，2%的醋酸（图1右下），以2.2节中所提及方法，进行抑菌性试验，测定平板形成抑菌圈大小，试验结果如表3所示，结论显示：以 1%醋酸溶液为溶剂，质量浓度为1，5，10，20，50 mg/mL的壳聚糖溶液均未产生抑菌环，说明以1%醋酸溶液为溶剂配置的不同质量浓度的1~50mg/mL壳聚糖溶液以及对照1%醋酸对幽门螺旋杆菌生长均没有抑制作用，但以2%醋酸溶液为溶剂，配置的壳聚糖溶液，质量浓度为20，50mg/mL的壳聚糖溶液均出现极小的抑菌环，阴性对照2%的醋酸溶液的抑菌圈半径为1mm，从结果分析可能是2%醋酸溶液对幽门螺旋杆菌有抑菌作用，阳性对照为10mg/mL甲硝唑溶液。

以无菌水为溶剂溶解，配置不同浓度的羧甲基壳聚糖，根据表2抑菌环测试显示，不同浓度的羧甲基壳聚糖均未形成抑菌环，说明这些浓度的羧甲基壳聚糖不具备抑制幽门螺旋杆菌的作用，另外表中的阳性对照为10mg/mL甲硝唑溶液，阴性对照为无菌ddH2O。

注：1）平板示意图如图a所示，10mg/mL壳聚糖（图1左上）、5mg/mL壳聚糖（图1右上）、1mg/mL壳聚糖（图1左下）以及空白对照1%，2%的醋酸（图1右下）；

2）图b是待测物20mg/mL壳聚糖（图b左上）、阴性对照 2%醋酸（图b右上）、阳性对照甲硝唑溶液（图b左下）以及空白对照（图b右下）的抑菌结果；

3）图c是待测物10mg/mL羧甲基壳聚糖（图c左上）、5mg/mL羧甲基壳聚糖（图 c右上）、1mg/mL羧甲基壳聚糖（图c左下）以及对照无菌 ddH2O（图c右下）的抑菌结果。试验结果表明，3种不同浓度的羧甲基壳聚糖溶液以及对照无菌 ddH2O 对幽门螺旋杆菌的生长均没有抑制作用。

图 1 壳聚糖以及羧甲基壳聚糖抑菌平板示意图

Fig.1 Inhibit circle picture of Chitosan and carboxymethyl chitosan

3.2不同脱乙酰度的壳寡糖原料对幽门螺旋杆菌的抑菌作用研究以及最小抑菌浓度的确定

脱乙酰度是壳寡糖产品好坏的重要指标，脱乙酰度的高低直接决定其在溶液中的溶解性，脱乙酰度越高，抑菌性越高；目前，大部分已有报道推测壳寡糖对于幽门螺旋杆菌的抑菌作用可能与酶切方式、pH 值、浓度有关，但还并未有报道研究脱乙酰度对于抗幽作用的影响。

通过对比两种不同脱乙酰度的壳寡糖原料，以无菌水为溶剂分别溶解配置成不同浓度的壳寡糖溶液，以2.2节中介绍的试验方法测定壳寡糖A和B的体外抑菌情况，以下是通过抑菌试验获得的抑菌环数据。

通过试验结果可以看到，不同浓度的壳寡糖A未能在平板上生成抑菌环，而壳寡糖原料B能够具备抑制幽门螺旋杆菌的作用，最小抑菌质量浓度为50mg/mL。在该浓度下，所配置而成的壳寡糖溶液能有效抑制幽门螺旋杆菌的生长，生成半径约为4mm的抑菌圈，阳性对照为配置而成的10 mg/mL甲硝唑溶液，阴性对照为无菌ddH2O。

图2 壳寡糖对幽门螺旋杆菌的抑菌平板示意图

Fig.2 Inhibit circle picture of chitosan oligosaccharide

注：（1）图a中为50mg/mL壳寡糖原料A（图a左上）、20mg/mL壳寡糖（图a右上）、阳性对照10mg/mL甲硝唑（图a左下）以及无菌ddH2O（图a右下）的抑菌结果。试验结果表明，50mg/mL的壳寡糖A溶液以及20mg/mL羧甲基壳聚糖对幽门螺旋杆菌的生长均没有抑制作用，阳性对照10mg/mL甲硝唑能明显抑制幽门螺旋杆菌的生长，抑菌圈半径为5.3mm。2）图b是待测物：厦门蓝湾科技有限公司生产的壳寡糖原料B所配置的壳寡糖溶液：50mg/mL壳寡糖（图b左上）、10mg/mL甲硝唑（图b右上）、无菌ddH2O（图b左下）以及1%醋酸（图b右下）的抑菌结果。3）图c是待测物10mg/mL壳寡糖（图c左上）、5mg/mL壳寡糖（图c右上）、1 mg/mL壳寡糖（图c左下）以及 ddH2O（图c右下）的抑菌结果。

3.3 高脱乙酰度壳寡糖B对于幽门螺旋杆菌生长曲线的影响

分别选择壳寡糖（50mg/mL），壳寡糖B（50mg/mL）以及甲硝唑（10mg/mL）作为研究对象，与幽门螺旋杆菌进行培养，对照组（control）为不添加壳寡糖的幽门螺旋杆菌，初始菌浓度与试验组相同，所有组别保证溶液的初始菌浓度为107CFU/mL，以空白培养基溶液为吸光度值调零，以菌体吸光度OD625为考察指标，讨论不同壳寡糖溶液对于幽门螺旋杆菌生长曲线的影响。

根据图3的生长曲线试验结果显示：对照组的菌体正常生长，10~20h 为菌体的对数生长期，20h后菌体生长进入稳定期。而试验组（COS B+HP）中由于加入质量浓度为50mg/mL的壳寡糖，使得菌体的生长受到抑制作用，导致实验组所积累的菌体生物量远低于对照组（菌体的吸光度值下降），试验组（COS A+HP）中的生长曲线与对照组的生长基本一致，生长趋势和生物量无明显区别，加入甲硝唑的组别菌体生长受到明显抑制，生物量积累明显低于所有其它试验组和对照组，另外通过t检验显示所有试验组与对照组结果有显著差异（P＜0.05）。

图 3 不同物料对幽门螺旋杆菌的生长曲线的影响

Fig.3 Effect on the HP’s growth curve with different experiment group

4 结论

近年来，学者们对于壳寡糖及其相关产物的体外抑制幽门螺旋杆菌的作用有了初步的研究成果[16]。谢勇等[17]在研究中提出壳聚糖、羧甲基壳聚糖对幽门螺旋杆菌具有抑制作用；薛海波等[18]提出通过内切酶制备工艺对产物抗幽作用的影响；李温静[19]在研究中提到特殊的壳寡糖具备一定的体外抗幽门螺旋杆菌作用。陈建国等[20]提到内切酶、外切酶以及混合酶的制备工艺对于产物是否具有抗幽作用有重要影响。

在本次研究中选择自主制备的甲壳质衍生物中代表性产物、壳聚糖、壳寡糖以及羧甲基壳聚糖为研究对象，研究不同种物料对于幽门螺旋杆菌的最小抑菌浓度（MIC)，一般来说，打孔法适用于溶解性好的样品；但壳聚糖的水溶性较差，所以本研究中采用不同浓度的醋酸溶液溶解壳聚糖进行研究，而羧甲基壳聚糖及壳寡糖的水溶性较好，可以直接选用无菌 ddH2O进行溶解。采用不同浓度的壳聚糖和羧甲基壳聚糖进行试验，未发现其具备体外抑制幽门螺旋杆菌的作用，可能于不同取代位置与分子质量区间有关；而壳寡糖组试验结论显示，厦门蓝湾科技有限公司自主生产的高脱乙酰度壳寡糖经过验证在质量浓度为50mg/mL时能够对幽门螺旋杆菌产生较强的体外抑菌作用，抑菌圈半径为（4.1±0.23）mm，质量浓度为10mg/mL阳性对照（甲硝唑）的条件下，所形成的抑菌环半径为（5.5±0.15）mm，试验中采用的低脱乙酰度的壳寡糖未产生抑菌圈，同时从共培养结果来看，高脱乙酰度的壳寡糖B（50mg/mL）可以明显抑制幽门螺旋杆菌的生物量积累，反之壳寡糖A（50mg/mL）则不具备相应的抑制作用；分析原因可能是由于高脱乙酰度的壳寡糖拥有较高的生物利用度，水溶性更好，能够更好的与细胞膜上的受体蛋白锚定并特异性结合，当与细胞体内带有阴离子的细胞质发生物理聚合作用，进而扰乱细胞正常的生理活动，抑制幽门螺旋杆菌的正常代谢，进而影响菌体的生长。

综上，在本研究中由厦门蓝湾科技有限公司生产的高脱乙酰度的壳寡糖具备一定的体外抑制幽门螺旋杆菌作用，未来可以进一步完善在抗幽试验的深入研究。

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