简介
腺相关病毒 (AAV) 是细胞治疗研究最活跃的基因治疗载体之一。它最初被发现是腺病毒制剂的污染物，是一类单链线状DNA缺陷型病毒(Naso et al.)。AAV是当前体内基因治疗的主要形式已经诞生数种经批准的相关药物，并在不同临床试验阶段中有着数百项针对眼部、肝脏、肌肉或中枢神经系统适应症和心血管及肺部疾病的新研究 (Julien Sylvestre)。AAV基因治疗已被证实为安全、耐受性良好且有效的方式且相关形式及工艺也在逐渐完善(Dmitry A. Kuzmin)。
AAV病毒
腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AAVS1位点。这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
AAV的选择
目前通过分析AAV使用的载体和培养盒，AAV2血清型在整个研究期间仍然是最常用的，并且有着最高的安全性及效率，同时自2005年起，使用 AAV8 和 AAV9 衣壳递送至中枢神经系统 (CNS) 的药物试验数量有所增加，这反映出基因疗法在中枢神经系统疾病中的应用有所增加。一些新兴的血清如AAV-LK03, SPK-100 and AAV-HSC15也开始被使用，但是其有效性及安全性仍待认证。但是最多的仍是CBA、CAG 和 CMV这一类，其有效性也经过记录验证(Dmitry A. Kuzmin)。
Source: Dmitry A. Kuzmin, Maria V. Shutova, Natalie R. Johnston, Owen P. Smith, Vasily V. Fedorin, Yury S. Kukushkin, Johannes C.M. van der Loo & Elaine C. Johnstone. "The Clinical Landscape for Aav Gene Therapies." Nature Reviews Drug Discovery 20, 173-174 (2021) (2021).
AAV工艺流程
AAV 病毒载体的生产是一个复杂的过程，需要创新的方法来满足安全性和有效性要求、临床和市场需求以及商品成本目标。其中制备稳定的病毒载体，防止其在制造、处理和储存过程中降解，并保持其长期稳定性和功效是 AAV 制造商面临的主要挑战。需要结合传统方法和新技术来开发可扩展且稳健的基因治疗产品制造工艺(Srivastava et al.)。目前AAV的生产主要是通过体外转染293T细胞的方式进行的，其制备和生产过程必须按要按照GMP要求进行。AAV工艺生产主要包括质粒制备、病毒包装和病毒纯化，在保证生产安全的条件下，最终病毒需要达到一定的滴度才能称为合格的产品。
Source: Srivastava, Arvind, et al. "Manufacturing Challenges and Rational Formulation Development for Aav Viral Vectors." Journal of Pharmaceutical Sciences 110.7 (2021):
上游工艺中，AAV 可以通过在贴壁或悬浮生物反应器中培养细胞来生产(Julien Sylvestre)。其流程为：
(1) 质粒开发和生产，负责设计生产其中的顺式质粒（可以编码有兴趣的基因 (GOI)并AAV 反向末端重复序列 (ITR)在其两侧），反式质粒（编码 AAV rep 和 cap 基因），以及辅助质粒（编码腺病毒 (Ad) 辅助基因、E2A、E4 和 VA RNA)；
(2) 细胞扩增，将 E1 转导细胞（例如贴壁 HEK293T 或悬浮 HEK293）扩增至所需的细胞密度;
(3) 质粒转染，在细胞达到所需的细胞密度后将质粒引入细胞;
(4) 病毒载体生产，瞬间转染的细胞随后可以在数日内生产病毒(Srivastava et al.)。
References list
Dmitry A. Kuzmin, Maria V. Shutova, Natalie R. Johnston, Owen P. Smith, Vasily V. Fedorin, Yury S. Kukushkin, Johannes C.M. van der Loo & Elaine C. Johnstone. "The Clinical Landscape for Aav Gene Therapies." Nature Reviews Drug Discovery 20, 173-174 (2021) (2021). Print.
Julien Sylvestre, Philip Conti-Permanne. "Emerging Technologies & Companies in Cell & Gene Therapy Manufacturing." Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(11), 1601–1649 (2022). Print.
Naso, M. F., et al. "Adeno-Associated Virus (Aav) as a Vector for Gene Therapy." BioDrugs 31.4 (2017): 317-34. Print.
Srivastava, Arvind, et al. "Manufacturing Challenges and Rational Formulation Development for Aav Viral Vectors." Journal of Pharmaceutical Sciences 110.7 (2021): 2609-24. Print.
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