一、免疫原性考量
对于ADC来说，与所有的蛋白质治疗药物一样，评估其免疫原性对了解其随时间而变化的药代动力学（PK）、安全性以及有效性的影响有着非常重要的意义。桥连LBA（ bridging LBA）是目前最常用的检测抗药抗体（ADA）的方法。
目前的监管指南建议使用多层级的ADA生物分析策略，即筛选、确证、滴度的层级。其核心的前提是检测层级都正交的，确证试验可以从筛选试验中剔除假阳性，而滴度试验用于量化免疫应答的强度。如果采用简化的层级策略，需要根据分析方法的性能特征来决定，包括检测范围、灵敏度、特异性及药物耐受。对于简化的层级策略，鼓励申办方在关键的临床试验前与监管机构进行沟通。
ADC属于多结构域药物，针对其域特异性的ADA表征和中和抗体的检测，需要根据临床研究的免疫原性风险进行评估，可参考《药物免疫原性：定义、影响、机制、因素、风险、内容、策略》《对多结构域大分子生物药的免疫原性的表征》。其免疫原性的相关风险主要来源于抗体、连接子、载荷或联合表位。基于目前的临床研究数据，与传统的治疗蛋白相比，ADC并没有明显的更高的免疫原性。至于患者相关的风险，因为目前已经获批的ADC均用于肿瘤治疗，所以患者过往接受的化疗治疗可能会影响到其基线的免疫状态，使得其产生ADA的易感性相对降低。
二、ADC可溶性靶点考量
由于ADC同可溶性靶标存在相互作用的关系，并且处于多种状态的动态平衡。因此游离靶标、总靶标以及与ADC结合后的靶标（即靶标-ADC复合物）之间的区分就变得十分重要。FDA的指导原则指出，如果ADC的靶标大量脱落或者分泌到血液循环中时，应使用生物分析方法来区分未与靶标结合的ADC（即游离态）和已与靶标结合的ADC。此时可溶性靶标可以阻止一定剂量的ADC到达作用部位，从而降低临床疗效。因此开发出检测游离靶标的方法就可以得到重要的数据，利于确定有效剂量。
LBA通常是测定可溶性靶标的首选平台。在开发可靠的游离靶标检测方法或者替代的总靶标检测方法的时候，需要考虑以下几个方面：1）靶标生物学特性，包括靶标的丰度低以及分析方法灵敏度需求高等因素；2）捕获试剂与检测试剂的选择，需评估其对靶标与ADC平衡状态的影响；3）相关技术挑战，如何优化检测条件以尽量减少对血液循环中形成的靶标-ADC复合物的干扰。
对游离靶点检测的方法开发中，应该选择与ADC治疗药物具有相同或者更低的亲合力（avidity）的靶点捕获抗体。另外为了尽量减少对现有样本平衡的破坏及并降低高估游离靶标浓度的风险，也可以直接使用ADC治疗药物本身作为捕获试剂。可以通过控制检测条件来缓解潜在的检测偏差，比如降低样品的稀释倍数、缩短孵育时间等。大多数情况下ADC与游离靶标的高摩尔比会妨碍准确定量，因此当ADC的浓度明显大于靶标浓度时，循环中可能几乎不存在游离靶标，此时尝试定量测定游离靶标可能难以得到任何具有生物学意义或实用价值的数据。
对于总靶标测定来说，动态范围十分重要，因为总靶标数据可以体现ADC对靶标蓄积的影响。由于ADC的半衰期比游离靶标长，所以给药后形成的 ADC-靶标复合物不会像游离靶标那样被迅速清除。同时，开发总靶标测定方法往往很困难，因为要同时检测游离靶标和结合态靶标。因此为了得到准确的定量结果，靶标测定需要进行预处理步骤，例如，在LBA测定前用酸解离法将结合态靶标从ADC上分离出来。需要明确的是，要明确所建立的检测方法到底是检测的游离靶标还是总靶标，并根据应用场景（context of use,COU）确定该测定方法的适用性。当基于LBA的总靶标测定开发失败时，可以考虑采用LC-MS/MS测定总靶标。
三、试剂考量因素
关键试剂是ADC生物分析方法的基础，其使用贯穿了从药物发现到临床检测的各个阶段。由于ADC的复杂性，要了解所有与该分子相关的各方面属性（即ADC以及其组成成分），需要用到多种分析方法和试剂。试剂的选择和用量视所用的某种特定生物分析策略和技术而定。采用LBA或LCMS/MS检测方法时，关键试剂必须不受疾病状态的影响，并且满足一定的选择性。
在药物发现与临床前阶段，市面上可以买到的针对常见表位的单克隆抗体、多克隆抗体可以作为关键试剂使用。从信誉好的供应商处购买该材料有利于保证批次间的一致性，减小批次之间的差异。但是对其适用性进行严格的验证也是非常必要的。临床阶段，需要专门制备出针对特定ADC的专属试剂，可能包括抗载荷抗体或者抗独特型抗体。建议在临床试验启动前至少1年启动试剂的开发工作，以确保试剂的开发及时可用。
由于临床项目周期长达数年，保证试剂的批次间可重复性及长期功能稳定性，对于维持检测方法稳定有重大意义。全面的试剂表征通常包括浓度、纯度、标记度等。除了物理、功能的评价之外，试剂验证作为检测流程确认的一个环节对于项目的成功来说也是很重要的。当使用新的批次试剂时，如果可行，建议使用单一方法对新旧两个批次之间进行桥接验证。为了尽可能减少变异，建议大批量生产和标记试剂。严格控制并且监测储存条件是十分重要的，因为任何偏差都会造成试剂完整性及性能的变化。
四、稳定性考量
大量的研究已经证明，ADC的稳定性受抗体偶联化学过程和连接子化学稳定性的影响，不可裂解的连接子一般比可裂解的连接子体内稳定，并且未偶联的载荷也较少。除此之外，样品前处理条件也可能使载荷在体外从ADC上脱落。载荷的潜在释放速率还会受光敏感性、物种特异性酶活性、基质pH值范围、溶血敏感性等其他因素的影响。研发早期做稳定性测试，可以给毒理学研究和临床研究中的样品采集与处理提供依据。
以光敏性喜树碱衍生物载荷（德鲁替康，DXd）为例，了解它的特殊处理要求对生物分析很重要。DXd载荷在活性内酯环形式和无活性羧酸盐形式之间通过pH值进行转换。低pH环境（pH＜6.0）中DXd抗体偶联物的降解速度小。避光时波长超过530 nm的光源(如LED)引起的降解极少，琥珀色和环烯烃聚合物的小瓶比透明玻璃的小瓶具有更好的保护效果。
在载荷稳定性测试中，一种方法就是制备空白、低浓度及高浓度载荷质控（QC）的基质样品，用浓度约为Cmax的ADC进行加标。在有ADC的情况下测得的质控值和没有加入ADC所制备的质控值相比较；由于ADC参考物质中可能含有未结合的药物，所以零时刻的标称浓度需要做相应的调整。两组QC样品应在不同的稳定条件下来监测。若检测出解偶联现象，则要采取相应的缓解措施，包括：在超低温储存(温度在-70℃左右)、添加酸或者抗氧化剂等添加剂以及提取过程中的冰浴。
五、阶段特异性的ADC生物分析策略
PK/ADME的考量因素会随着整个研发过程的变化而变化，因此生物分析方法要根据各个阶段来定制。
1）药物发现的早期阶段
在这个阶段，ADC的生物分析对得到非临床物种中的PK数据、疗效以及毒性的数据很重要，这些数据为候选药物的筛选提供依据。主要检测的分析物有：总抗体（tAb）、ADC、游离未偶联载荷、具药理活性的载荷衍生代谢物以及DAR分布。当非典型的药代动力学特征预示着可能存在ADA介导的清除现象的时候，就应当对ADA抗进行检测。发现阶段的检测方法一般是以满足目的（fit-for-purpose）为原则，侧重于灵活和快速检测。
2）GLP毒理学研究阶段
在这个阶段，重点就变成提高数据的完整性、可重现性和合规性。ADC毒理学研究一般在啮齿类动物和非啮齿类动物两种物种上进行，所有支持GLP研究的生物分析方法都必须按照M10指南进行完整的验证。该阶段ADC分析物组合会被压缩为对于解读全身暴露情况和毒理学发现所必需的项目。
3）临床开发阶段
在临床早期阶段，生物分析继续聚焦于ADC相关分析物，使用经过验证的方法来支持安全性评价以及暴露量特征分析。在临床开发后期阶段，生物分析范围可以进一步简化，集中关注与暴露-效应关系、及监管决策最为相关的ADC分析物。例如，如果高灵敏度检测方法不能测出游离载荷水平，则不用再测量游离载荷。同样地，如果tAb与ADC浓度之间存在很强的相关性，尤其是当该抗体主要作为递送载体的时候，那么就可以不再对tAb进行定量测定。
除了分析物选择之外，检测平台与关键试剂也会随着药物的发现和开发阶段进行逐步的演进：通常从通用型试剂过渡到抗独特型试剂，从探索性的检测方法转变为经过充分验证的LBA法或者LC–MS/MS法。实际上，这些转变是由于提高灵敏度、特异性，减少基质或代谢物干扰，以及研发项目进入GLP、临床阶段需要满足监管验证标准而驱动的。在开发过程中如果更改检测方法或者关键试剂时，则需做正式比对以保证PK数据解释的一致性和连续性。
尽管LC-MS/MS可以提高对ADC及其组分的分子特异性，但是LBA方法在低临床暴露量的情况下具有更高的灵敏度，因此平台的选择仍然依赖于分子类型和阶段，下表给出了试剂制备以及各阶段检测方法选择的一般工作流程。
ADC研究试剂制备以及各阶段检测方法选择的一般工作流程
六、交叉验证策略
ADC的生物分析测试策略一般涉及对PK和免疫原性评估中的多种分析物进行检测。不同实验室之间数据交叉验证时，需要对每种方法在两个实验室间可比性做单独评价。研究过程中使用了多种技术（LC–MS/MS与LBA等），那么这两种方法的可比性也都应该被考虑进去。FDA（2018）以及M10指南(2022年)对于PK交叉验证提供了相关建议，包括何时进行交叉验证、入选样本的选择、用统计工具来判断两种方法之间的一致性等。
LC-MS/MS、LBA方法PK交叉验证需要≥30份真实样本（如有）或者由统计人员根据前期研究历史数据来确定样本量。普遍认为，ADC在给药之后会因为解偶联或者生物转化而产生DAR的变化。所以交叉验证设计中要包含研究样本和加标QC样品。所选研究样本应当能涵盖所有的变化范围及生物学状态，包括疾病状态的基质等，从而保证其可以正确反映给药后时间推移可能发生的各种变化。
对于ADA、NAb检测，在指定方法比较的策略时需要充分考虑临界值、试剂、检测灵敏度、药物耐受性、阳性率及滴度等各方面存在差异。依据免疫原性风险，需要对一个或者几个特定结构域的特异性进行交叉比较。
由于ADC生物分析的复杂性，在方法转移时用有限数量的质控品和混合样本进行初步评价，保证不同实验室间试剂、技术和分析执行方面的可比性。每项生物分析交叉验证或者比较都应该遵循相关法规推荐的标准和规范，比如M10。由于ADC药物类型一般会采用不同的生物分析方法，包含一些在其它治疗领域中不会被使用到的技术，从而给参与交叉验证的两个实验室的能力与专业知识等方面带来挑战，这同时也决定了是否要由单一中心承担多项方法的执行。
当交叉验证数据出现明显偏倚的时候，必须客观评估数据，并找出一种或者两种方法的潜在偏倚来源，理解差异的根本原因。由于ADC需要多种生物分析方法来进行定量检测，因此该偏倚会对之后的结果解读产生更大的影响，例如药PK暴露量或者暴露量-效应评价。
七、用于监管申报的ADC生物分析注意事项
准确定量生物基质中ADC及其组成成分，对于确定关键PK参数、是为有关ADC安全性和有效性的监管决策提供依据的前提。为了保证向监管机构提交的数据是可靠的，用作此类测定的生物分析方法应当被开发、验证并且完善记录在案。相关指导原则（如M10）阐明了监管机构对生物分析数据的要求，也说明了ADC申报资料中数据可靠性的重要性。
一般来说，从首次人体研究开始，就应当使用经过验证的检测方法来测定ADC及其组成成分。在后续开发阶段，则应测定ADC、其组成成分及体循环中可以定量的有药理活性的代谢物，用以说明各组分的PK特性，为暴露量-反应分析提供依据。所有的生物分析方法都应该被验证，并且研究样本分析应该按照《M10生物分析方法验证和研究样本分析》指南中的要求来报告。
由于许多ADC载荷的效力极高（通常IC₅₀在pM至nM范围的细胞毒性药物），因此游离载荷浓度的微小变化都会对安全性造成重大的影响。FDA认为：未偶联载荷的测定方法要具有足够的灵敏度，能够检测出全身暴露量的细微变化。未偶联载荷测定的定量下限（LLOQ）应该根据载荷的效力、作用机制、毒性特征和分布特性来确定。对高效力的载荷来说，可能需要将定量下限定为亚ng/mL级别（一般为10~50pg/mL），这样才能与观察到的毒性反应相关联。这就要求所用的分析方法的灵敏度至少要比引起不良反应的浓度低10倍。虽然以pg/mL为单位的定量下限会带来一定难度，但是LC-MS/MS技术的发展，如分离技术（色谱）的改进以及更灵敏的检测器，则有利于提高定量限。
FDA给出了指导文件以及网络研讨会等多种形式的资源，并且要求申办方在药物研发的过程中尽早和监管机构进行沟通，获得反馈意见。近期在申办方与FDA之间召开的监管里程碑会议、指导会等（pre-IND会议、C类和D类会议）上，对生物分析问题及挑战的专门讨论也增多起来。毋庸置疑，稳健、可靠、可重复的生物分析方法对于药物的研发成功来说是十分重要的。
完结！！
