干货 | 基因表达调控研究工具:双荧光素酶报告基因

1、实验原理

双荧光素酶基因报告系统是一种常用于评估基因调控元件（如启动子、增强子或microRNA靶点）活性的实验方法。

该系统通常涉及两个质粒的共转染，其目的是为了提供更准确和可靠的实验数据。这两个质粒及其作用如下：

报告质粒（Reporter Vector）

• 这个质粒包含了待研究的调控序列上游的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase, Fluc）基因。这个调控序列可以是启动子、增强子或其他顺式作用元件。

• 当细胞被转染后，如果调控序列活跃，则会驱动萤火虫荧光素酶基因的表达。通过测量萤火虫荧光素酶的活性，我们可以间接了解目标调控序列的功能或活性水平。

内参质粒（Control Vector）

• 内参质粒通常携带海肾荧光素酶（Renilla luciferase, Rluc）基因，作为内部对照使用。它不受实验处理的影响，并且在实验设计中保持恒定表达。

• 海肾荧光素酶的作用是标准化实验结果，以校正由于细胞数量差异、转染效率变化或其它实验条件波动带来的影响。通过比较两种荧光素酶的相对活性，可以获得更加可靠的数据。

通过同时转染这两个质粒并检测两种不同类型的荧光素酶活性，研究人员可以得到关于特定调控序列功能的信息，同时确保实验结果的稳定性和可重复性。

这种方法广泛应用于生物学研究中，尤其是在探索基因表达调控机制时。

2、实验流程

图：AI生成

3、实验步骤

d、细胞裂解：

转染后48 h左右，去除培养基，用PBS清洗细胞1~2次，加入细胞裂解液，室温裂解细胞15~30 min左右，以保证细胞充分裂解。

1. 先计算出每孔的Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase的比值(F/R);
2. 求出miRNA-Ctrl三个重复孔的平均值(average1)
3. 再以miRNA-Ctrl组的average1为标准1进行标准化，即用miRNA mimic组的F/R三个重复值分别除以相对应组别average1得到三个比值
4. 上一步中求出的比值的平均值作为average2，并分别用average1和average2的值作柱状图

• 双荧光素酶活性升高：
  若实验组的RLA值显著高于对照组，例如对照组RLA为1，实验组RLA为3，通常提示所研究的调控元件对报告基因（萤火虫荧光素酶）的转录具有激活作用，即可能促进了目标基因的表达启动或增强了表达水平。
• 双荧光素酶活性降低：
  当实验组的RLA值明显低于对照组时，比如对照组RLA为1，实验组RLA为0.5，则表明该调控元件可能抑制了报告基因的转录，使目标基因表达量相对减少。
• 无显著差异：
  若实验组与对照组的RLA值相近，且经统计学分析不存在显著差异，说明在所设定的实验条件下，该调控元件对目标基因转录可能没有明显的调控作用。

4、注意事项

• 试剂准备与保存：
  萤火虫荧光素酶底物LARII需按需分装，-80℃避光保存，避免反复冻融；海肾荧光素酶底物Stop&Glo需现配现用。
  配好的LARII在-20℃可稳定一个月，在-70℃可稳定一年。
• 细胞转染：
  注意转染试剂的质量和使用说明，不同细胞系对转染试剂的敏感性可能不同，可进行预实验优化转染条件，如转染试剂的用量、细胞密度、转染时间等。
• 对照组设计：
  设立阳性和阴性对照，以确保转染的成功和实验结果的可靠性。例如，可设置转染空载体的阴性对照和已知有相互作用的阳性对照组合。
• 实验操作要点：
  整个实验过程要注意避光，尤其是在试剂配制、细胞裂解后以及荧光检测过程中，防止荧光素酶底物见光分解影响检测结果。
  实验操作尽量在短时间内完成，一般建议在30 min内，以减少细胞裂解产物等在室温下放置时间过长可能导致的活性变化。
  样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内，通常1-2s，以保证检测结果的准确性和可比性。
• 结果分析与问题排查：
  如果测量的荧光值较低，首先排除转染效率问题，可通过在12孔板多铺一孔细胞转染荧光质粒，观察转染的荧光效率；若排除转染问题后荧光读值仍然较低，可以尝试增加转染质粒量。
  若测量的荧光值过高，则可减少转染质粒量，或者适当稀释细胞裂解离心后的上清液。
  若背景过高可能影响结果的准确性，需检查试剂是否被污染、细胞是否有自发荧光等问题，并采取相应的解决措施。

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大家记得把细胞之邦设为星标?哦～