1. 摘要

在生物医药领域，利用植物来源的 microRNA（miRNA，微小核糖核酸）进行跨界基因调控（Cross-Kingdom Regulation）以治疗人类癌症，是一个兼具高度创新性与巨大挑战的命题。本报告针对“利用植物来源 miRNA mimic 抑制肿瘤生长并开发成药”这一核心议题，进行了全方位、深度的可行性分析。分析涵盖了从基础生物学机制、化学制造与控制（CMC）、药物递送系统、安全性与毒理学、知识产权（IP）布局到临床注册法规的各个关键环节。

虽然早期研究表明植物 miRNA（即“异种 miRNA”或 Xenomirs）可能通过饮食摄入进入哺乳动物循环系统并调控基因表达，但对于药物开发，依赖天然提取物或仅仅依靠“饮食补充”模式在药代动力学（PK）和药效学（PD）上存在难以逾越的障碍。当前的科学共识与制药工业实践指向了一条明确的路径：植物 miRNA 的核苷酸序列应作为先导化合物（Lead Compound），通过化学合成与修饰转化为全合成的寡核苷酸药物（Synthetic Oligonucleotide Therapeutic），而非开发为植物提取物或中药制剂。

报告深入分析后得出结论：将该 miRNA mimic 开发为药物在理论上是可行的，但必须克服三大核心瓶颈：

1. 化学修饰的必要性：天然 RNA 极不稳定且易引发先天免疫反应（如细胞因子风暴），必须引入 2'-O-甲基化、硫代磷酸酯骨架等化学修饰以提高稳定性和降低免疫原性。

2. 递送系统的精准性：对于非肝脏实体瘤，脂质纳米颗粒（LNP）的被动靶向效应不足，需开发配体偶联或抗体偶联（AOC）等主动靶向技术。

3. 知识产权的保护：由于天然序列本身不可专利（根据 Myriad 案判例），必须通过特定的化学修饰模式和制剂配方来构建专利护城河。

本报告旨在为研发团队提供一份详尽的成药性评估蓝图，指导从实验室概念验证（Proof of Concept）向临床前研究（IND-enabling studies）的转化。

2. 生物学基础：异种 miRNA 的跨界调控机制与争议

植物 miRNA 能否在人体内发挥功能，是本项目立项的生物学基石。这一领域经历了从轰动性的发现到激烈的学术争议，再到机制逐渐清晰的演变过程。理解这一背景对于确定药物的作用机制（MOA）至关重要。

2.1 “异种 miRNA”假说的起源与验证

2012 年，Zhang 等人发表在《Cell Research》上的开创性研究首次提出了植物 miRNA 可以跨越物种界限调节哺乳动物基因表达的观点。研究发现，水稻来源的 miR168a 可以通过饮食进入小鼠和人类的血清，并特异性地靶向肝脏中的低密度脂蛋白受体衔接蛋白 1（LDLRAP1）mRNA，从而抑制其表达并导致血浆 LDL 水平升高 。这一发现挑战了传统的 RNA 不稳定性教条，即通常认为饮食中的 RNA 会被消化系统的核酸酶迅速降解。

随后的研究在一定程度上支持了这一假说，并扩展了潜在的机制和应用：

miR-159（来自西兰花/大豆）：被证实能靶向人类乳腺癌细胞中的转录因子 TCF7，进而抑制 Wnt 信号通路，阻断癌细胞增殖 。这与用户目前的发现（抑制肿瘤生长）在机制上具有高度的相似性。

miR-2911（来自金银花）：显示出惊人的稳定性，甚至能耐受煎煮过程。研究表明它能直接靶向流感病毒甚至 SARS-CoV-2 的基因组，抑制病毒复制，这提示某些植物 miRNA 的序列结构本身赋予了其特殊的稳定性。

2.2 吸收机制：污染还是真实摄取？

然而，这一领域也面临着严峻的挑战。多项大规模测序研究指出，许多公共数据库中人类样本里的植物 miRNA 读段（reads）实际上来源于实验室试剂或测序仪的交叉污染，而非真实的生物学摄取 。此外，对于植物 miRNA 如何穿过肠道屏障进入血液，科学界一直存在分歧。

直到近期，SIDT1（SID1 Transmembrane Family Member 1）蛋白在胃壁细胞中的发现为这一机制提供了分子基础。研究表明，在胃部的酸性环境下，SIDT1 介导了外源 miRNA 的吸收，而非传统认为的肠道吸收 。

对药物开发的启示：

对于用户而言，如果不打算开发口服制剂（Oral Formulation），则无需过多纠结于“肠道吸收”的效率。如果用户使用的是 miRNA mimic（模拟物） 进行细胞或动物实验并观察到了疗效，这说明该序列在进入细胞后确实能发挥功能。此时，药物开发的重点应从“天然吸收机制”转向“人工递送效率”。即便自然界中植物 miRNA 进入人体的效率极低，作为药物，我们可以通过脂质纳米颗粒（LNP）包裹将其胞内浓度提高数千倍，从而实现治疗效果。

2.3 作用机制（MOA）：特异性沉默与免疫激活的博弈

确定 miRNA mimic 抑制肿瘤的具体机制是成药的关键。目前主要存在两种可能性，且对药物安全性有着截然不同的影响。

2.3.1 经典 RNA 干扰（RNAi）路径

最理想的情况是，植物 miRNA mimic 进入肿瘤细胞后，被人类的 Argonaute 2 (AGO2) 蛋白识别并装载进入 RNA 诱导沉默复合物（RISC）。随后，该 miRNA 通过其“种子序列”（Seed Sequence，第 2-8 位核苷酸）与人类致癌基因（Oncogene）的 3' 非翻译区（3' UTR）互补配对，导致 mRNA 降解或翻译抑制 。

优势：特异性强，副作用可预测。

证据需求：需要通过 3' UTR 荧光素酶报告基因实验（Luciferase Assay）验证直接靶点，并通过 AGO2 免疫沉淀（RIP-Seq）证实该 miRNA 确实结合在人类 AGO2 蛋白上。

2.3.2 非经典免疫激活路径（Toll 样受体激活）

另一种可能性是，观察到的肿瘤抑制并非源于特定基因的沉默，而是源于免疫系统的激活。外源 RNA（尤其是单链 RNA 或富含 GU 的序列）是天然的危险信号分子（PAMPs），可被内体中的 Toll 样受体 7/8（TLR7/8）识别 。

机制：TLR7/8 激活后诱导 I 型干扰素（IFN-α）和促炎因子（如 IL-6, TNF-α）的分泌。这些细胞因子具有抗肿瘤活性，但同时也极其危险。

风险：这是 miRNA 药物开发历史上最大的“雷区”。著名的 MRX34（miR-34a mimic） 临床试验失败，正是因为高剂量的 miRNA mimic 诱发了无法控制的免疫反应（细胞因子释放综合征，CRS），导致受试者死亡 。

植物 miRNA 的特殊性：植物内源性 miRNA 通常在 3' 末端带有 2'-O-甲基化（2'-O-methylation） 修饰，这是由植物 HEN1 甲基转移酶催化的 。有趣的是，这种修饰在哺乳动物中被证明可以逃避 TLR7/8 的识别，降低免疫原性 。因此，植物 miRNA 可能天生具有比普通合成 RNA 更好的安全性，但在人工合成 mimic 时必须保留或增强这种修饰。

3. 药学研究（CMC）：从植物提取到化学合成的必然选择

在确定了生物学机制后，下一个核心决策是“原料药”的来源。是直接从植物中提取（Botanical Drug），还是进行化学全合成（Synthetic Drug）？对于抗肿瘤 miRNA 药物，行业标准和监管要求几乎一边倒地指向化学合成。

3.1 路径一：植物提取物（Botanical Approach）的局限性

虽然“天然来源”在保健品市场具有吸引力，但在处方药（Rx）开发中，直接提取面临无法克服的 CMC 障碍。

3.1.1 丰度与产率问题

植物组织中特定 miRNA 的含量极低。miRNA 仅占植物总 RNA 的极小部分（通常小于 0.1%）。

数据支撑：在典型的提取实验中，从 1 克植物组织中提取的总 RNA 仅为微克（μg）级别，而特定的目标 miRNA 可能仅占其中的万分之一 。

工业化挑战：若要制备临床试验所需的克（g）级甚至公斤（kg）级原料药，可能需要数吨甚至数十吨的新鲜植物原料。这在供应链管理、提取成本和环境影响上都是不可持续的。相比之下，化学合成的 miRNA mimic 在纯度达到 95% 以上时的成本虽然仍高，但随着合成技术的进步（如液相合成、大规模固相合成），其成本效益远高于从生物质中提取微量成分 。

3.1.2 异质性与批次间差异

植物的基因表达受环境因素（光照、温度、土壤、病虫害）的剧烈影响。不同批次、不同产地甚至不同收割时间的植物，其 miRNA 表达谱（Expression Profile）可能截然不同 。

监管难题：FDA 的《植物药研发指南》（Botanical Drug Development Guidance）虽然允许一定程度的混合物，但主要针对的是成分复杂且活性成分尚不完全明确的传统草药（如 Veregen）。对于 miRNA 药物，其活性成分是明确的核苷酸序列。监管机构无法接受药物中含有成千上万种“搭便车”的其他植物小 RNA、降解片段、多酚和内毒素，这些杂质可能带来不可预知的脱靶毒性 。

3.2 路径二：化学合成（Synthetic Approach）的必然性

目前所有获批的寡核苷酸药物（如 siRNA 药物 Patisiran, Givosiran）均采用化学合成。

3.2.1 固相亚磷酰胺合成法（Solid-Phase Phosphoramidite Synthesis）

这是目前寡核苷酸合成的工业金标准。通过在固相载体（CPG 或聚苯乙烯）上进行脱保护、偶联、氧化、盖帽的循环反应，可以精确合成特定序列的 RNA 。

优势：

纯度可控：可以通过 HPLC 或离子交换层析将全长产物（Full-length product）与 N-1、N+1 等失败序列分离，纯度可达 95-99%。

化学修饰的自由度：这是成药的关键。如下文所述，未经修饰的天然 RNA 在血液中半衰期仅几分钟，无法成药。只有通过化学合成，才能在特定位点引入非天然的化学基团。

3.2.2 关键化学修饰策略

为了将植物 miRNA 序列转化为药物，必须对其进行“重工程化”（Re-engineering）。

骨架修饰（Backbone Modification）：将磷酸二酯键（Phosphodiester bond）替换为硫代磷酸酯键（Phosphorothioate, PS）。这能显著抵抗核酸酶（Nucleases）的降解，并增加药物与血清蛋白（如白蛋白）的结合，从而延长体内循环时间 。

糖环修饰（Ribose Modification）：在核糖的 2' 位引入修饰，如 2'-O-甲基（2'-OMe）、2'-氟（2'-F） 或 锁核酸（LNA）。

作用：这些修饰不仅能防止水解，还能锁定 RNA 的构象（C3'-endo），增加其与靶 mRNA 的结合亲和力（Tm 值升高）。

免疫逃逸：如前所述，2'-OMe 修饰能有效伪装 RNA，使其不被 TLR7/8 识别，从而避免免疫毒性 。

导链与客链的不对称设计：miRNA mimic 是双链 RNA。为了防止“客链”（Passenger Strand，即互补链）被错误地装载进 RISC 复合物导致脱靶效应，通常会对客链进行大量的化学修饰（甚至完全修饰），使其无法作为功能链，而保留“导链”（Guide Strand，即活性链）的活性 。

CMC 结论：本项目的 CMC 策略应明确为“基于植物 miRNA 序列的全合成、化学修饰寡核苷酸药物”。植物仅提供序列灵感，不作为生产原料。

4. 药物递送系统：跨越生物屏障的挑战

如果说序列发现是 10%，化学修饰是 20%，那么递送系统（Delivery System）则占据了 RNA 药物研发难度的 70%。裸露的 miRNA mimic 带有高负电荷，分子量大（~14 kDa），亲水性强，无法穿过疏水的细胞膜，且极易被肾脏滤过清除 。

4.1 脂质纳米颗粒（LNP）：当前的金标准

得益于 COVID-19 mRNA 疫苗的成功，LNP 已成为最成熟的 RNA 递送平台。LNP 通常由四种脂质组分构成 ：

1.可电离阳离子脂质（Ionizable Lipid）：核心成分（如 DLin-MC3-DMA, SM-102）。在血液中性 pH 下呈电中性（减少毒性），在内体酸性环境（pH < 6.5）下质子化带正电，破坏内体膜，释放 RNA。2. 胆固醇（Cholesterol）：提供结构稳定性。

3.辅助磷脂（Helper Lipid, 如 DSPC）：模拟细胞膜结构。

4. PEG 化脂质（PEG-Lipid）：防止颗粒聚集，延长循环时间。

4.1.1 肝脏靶向的天然优势与局限

当 LNP 经静脉注射（IV）进入血液后，会吸附血清中的载脂蛋白 E（ApoE）。ApoE 会引导 LNP 与肝细胞表面的 LDL 受体结合，从而富集于肝脏。

机会：如果用户的植物 miRNA 针对的是肝癌（HCC） 或 肝转移瘤，目前的 LNP 技术已非常成熟，成药门槛最低 。

挑战：如果针对的是肺癌、胰腺癌、乳腺癌等肝外实体瘤，普通 LNP 难以穿透致密的肿瘤基质，且大部分药物会被肝脏截留（“首过效应”）。

4.2 突破肝脏限制：下一代递送技术

为了实现肝外肿瘤的治疗，必须采用主动靶向策略或新型递送载体。

4.2.1 配体偶联 LNP（Ligand-Targeted LNP）

在 LNP 表面修饰特定的配体，使其能结合肿瘤细胞表面的过表达受体。

RGD 肽：靶向肿瘤血管内皮细胞或肿瘤细胞表面的整合素（Integrins）。

叶酸（Folate）：靶向叶酸受体。

抗体片段（Fab）：如靶向 HER2 或 EGFR 的抗体片段。

技术难点：配体的修饰可能干扰 LNP 的稳定性，且容易在血液中形成“蛋白冠”（Protein Corona），掩盖配体的靶向功能。

4.2.2 抗体-寡核苷酸偶联物（Antibody-Oligonucleotide Conjugates, AOC）

这是一个新兴且极具潜力的领域，类似于抗体偶联药物（ADC）。

原理：将 miRNA mimic 直接偶联到单克隆抗体上。抗体负责像导弹一样精准寻找肿瘤抗原（如 Trop-2, Nectin-4），并将 RNA 带入细胞 。

优势：解决了肝脏富集问题，实现了真正的肿瘤组织特异性递送。

现状：目前 Avidity Biosciences 和 Dyne Therapeutics 等公司正在推进 AOC 的临床试验（主要针对肌肉疾病），但在肿瘤领域的应用正在快速升温 。

4.2.3 外泌体与植物外泌体样纳米颗粒（PENs）

既然miRNA 来源于植物，是否有天然的植物载体？研究发现，植物中存在类似外泌体的纳米颗粒（PENs），如生姜、葡萄来源的纳米颗粒，被认为可以包裹 miRNA 并抵抗消化 。

成药性评估：虽然概念迷人，但 PENs 的工业化生产（CMC）面临巨大挑战。如何从植物中提取均一、纯净、载药量一致的纳米颗粒？目前的质控标准远未达到药品监管要求。因此，PENs 更多处于科研阶段，而非即刻可用的药物载体。

递送策略建议：

首选：针对肝癌，直接使用成熟的 LNP 配方。

进阶：针对肝外实体瘤，优先考虑 AOC 或经过验证的靶向 LNP（如引入 SORT 分子调节电荷以靶向肺/脾 ）。

5. 安全性与毒理学评估

5.1 免疫毒性（Immunotoxicity）：最大的“拦路虎”

如前所述，miRNA 药物研发历史上最惨痛的教训来自免疫毒性。外源双链 RNA 极易诱发先天免疫反应。

临床表现：发热、寒战、低血压、肝酶升高，严重者导致多器官衰竭。

预防策略：

1.化学修饰：必须引入 2'-OMe 和 2'-F 修饰，特别是模仿植物天然的甲基化模式，这不仅是为了稳定，更是为了“隐身”于免疫系统 。

2.剂量控制：需进行严格的剂量爬坡试验。

3.预处理：在临床试验中，可能需要使用地塞米松（Dexamethasone）等皮质类固醇进行预处理，以抑制免疫反应 。

5.2 脱靶毒性（Off-Target Effects）

miRNA 的作用机制决定了其可能同时调控数百个基因。

种子区脱靶：即使 miRNA 与靶基因只有 6-8 个碱基（种子区）互补，也可能引起抑制。如果植物 miRNA 的种子区不幸与人类的某个关键管家基因（如心脏节律相关基因、细胞骨架基因）互补，可能导致严重毒性。

分析方法：在临床前阶段，必须通过生物信息学工具（如 TargetScan, miRanda）在全基因组范围内预测潜在的脱靶位点 ，并在转录组测序（RNA-Seq）中予以验证。

植物 miRNA 的潜在优势：由于植物与动物的进化距离极远，植物 miRNA 的序列在人类基因组中可能缺乏广泛的保守结合位点，这反而可能使其比人类内源性 miRNA 的 mimic 具有更少的脱靶副作用 。这是一个值得深入挖掘的理论优势。

5.3 载体相关毒性

LNP 并非惰性物质。阳离子脂质本身具有细胞毒性，并可能引起氧化应激或补体激活（CARPA 反应）。长期或高剂量给药可能导致肝毒性。因此，选择具有生物可降解性（Biodegradable）的新一代可电离脂质至关重要 。

6. 综合数据对比分析

为了更直观地展示成药性决策，以下表格对比了不同开发路径的关键参数。

表 1：植物提取物 vs. 化学合成 Mimic 成药性对比

表 2：主要递送系统在肿瘤治疗中的适用性

7. 结论与建议

利用该植物来源 miRNA 开发抗肿瘤药物在科学上和技术上是可行的，但前提是必须彻底脱离“植物药”的思维定式，转而采用现代核酸药物（RNA Therapeutics）的开发逻辑。

用户发现的植物 miRNA 应被视为一个序列代码（Sequence Code），以此为蓝本设计全合成的药物分子。植物本身仅是发现的源头，绝非生产的工厂。

综上所述，这一发现具有成为 First-in-Class 药物的潜力，但成药之路是一场精密的化学工程与生物医学工程的集成战役。只有以工业化的标准对抗天然分子的缺陷，才能最终将实验室的发现转化为造福患者的良药。

参考：

1. Zheng, L., Yang, T., Guo, H. et al. Cryo-EM structures of human SID-1 transmembrane family proteins and implications for their low-pH-dependent RNA transport activity. Cell Res34, 80–83 (2024). https://doi.org/10.1038/s41422-023-00893-1

2. Zhang, L., Hou, D., Chen, X. et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Res22, 107–126 (2012). https://doi.org/10.1038/cr.2011.158

3. 综合网络和AI。