1. 前言：止血与血栓遗传学的基因组学范式转移

止血与血栓形成（Hemostasis and Thrombosis）是一个高度精密调控的生理网络，涉及内皮、血小板、凝血因子、抗凝蛋白及纤溶系统的动态平衡。这一系统的失调将导致出血性疾病（如血友病、血管性血友病）或血栓性疾病（如静脉血栓栓塞症VTE、血栓性微血管病TMA）。随着分子遗传学的进步，已识别出数百个与上述病理过程相关的基因。在临床诊断中，明确致病变异不仅是确诊的金标准，更是指导个体化治疗（如抗凝时长、基因治疗资格评估）、遗传咨询的基石 。

长期以来，Sanger测序曾是基因诊断的“金标准”，但其通量低、成本高，难以应对大基因（如VWF, F8）或多基因疾病的筛查需求。二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术的普及彻底改变了这一局面。目前，临床主流的NGS策略主要分为全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES）和目标区域超深度测序（Targeted High-Depth NGS, HD-NGS）。

WES通常覆盖基因组中约1-2%的蛋白编码区，平均测序深度一般在100x-200x之间，被视为一种“广撒网”的策略，适用于表型复杂、致病基因不明的疑难杂症 ³。然而，在血栓与止血这一特定垂直领域，致病基因相对明确，但其基因组结构却异常复杂——普遍存在假基因干扰（Pseudogenes）、高GC含量区域、复杂的拷贝数变异（CNV）、深部内含子变异（Deep Intronic Variants）以及体细胞/生殖细胞嵌合体（Mosaicism）实现复杂特定垂直领域，我们采用HD-NGS（如241个核心基因-出凝血全系统基因）突破在低频嵌合体、内含子致病位点、微小CNV及假基因同源区段检测中的技术瓶颈，从而显著提升临床诊断率。

2. 技术架构对比：测序深度与覆盖均一性的决定性作用

2.1 测序深度的统计学意义：从200x到1500x的质变

测序深度（Sequencing Depth）是指特定碱基被测序读取的次数。它直接决定了变异检测的置信度，特别是在等位基因频率（Variant Allele Frequency, VAF）偏离标准的50%（杂合）或100%（纯合）时。

●WES（200x）的局限性：临床WES通常追求约100x-200x的平均深度。根据泊松分布（Poisson distribution），在平均深度100x的情况下，仍有相当比例的区域深度可能低于20x，这被称为“覆盖盲区”（Drop-out）。对于生殖系变异，通常要求至少20x-30x的深度来可靠地探寻杂合变异。然而，这一深度对于识别低频变异（<20% VAF）或进行精确的CNV定量分析是远远不够的 ⁵。

●HD-NGS（>1500x）的优势：HD-NGS通过富集特定的Panel，将测序资源集中，使目标区域的平均深度超过1500x。超高深度并非简单的冗余，而是为了：

1.捕捉极低频变异：能够以>99%的灵敏度检测出VAF低至1%的嵌合体变异 ⁷。

2.CNV的数字化定量：高深度将读取计数（Read Count）转化为高精度的数字信号，使得单外显子级别的缺失或重复在统计上变得显著，克服了WES数据的背景噪声 ⁹。

3.克服捕获效率：即使在捕获效率较低的区域，极高的基数也能保证最终获得的有效数据量满足诊断要求 ¹⁰。

2.2 覆盖均一性与GC偏好性挑战

血栓与止血相关基因中，许多关键基因的启动子区或第一外显子具有极高的GC含量（GC-rich），例如F8、PROS1、ADAMTS13及GP1BA等 ¹¹。

●WES的捕获偏差：WES使用的全基因组杂交探针库在GC含量极高或极低的区域杂交效率显著下降。研究表明，WES在GC含量>65%的区域覆盖度会急剧下降，导致以ADAMTS13第一外显子为代表的关键区域经常出现测序空白 ¹⁴。这种系统性的覆盖不均是WES漏检的重要原因。

●HD-NGS的优化策略：针对241个特定基因设计的HD-NGS panel，针对高GC区域采用“平铺”探针（Tiling Probes）及增加探针密度（Spiking）。从而显著提升高GC区域的覆盖均一性，确保如PROS1启动子区等调控序列被完整测序 ¹⁰。

表 1：WES与HD-NGS在血栓止血基因检测中的技术参数对比

3. 嵌合体（Mosaicism）检测：突破遗传病的“全或无”认知

嵌合体现象，即在一个体中同时存在两种或多种基因型的细胞系，是导致“散发性”血栓与止血疾病的重要机制。传统的遗传检测假设变异为生殖系来源（VAF~50%），往往忽略了低频嵌合体，导致诊断遗漏或误判复发风险。HD-NGS凭借超高深度，成为检测此类变异的唯一可靠手段。

3.1 血友病（F8 / F9）中的母源嵌合体

血友病A（F8）和血友病B（F9）中，约30%的病例为散发性（无家族史）。研究表明，在这些散发病例的母亲中，相当一部分并非全身性的携带者，而是生殖或体细胞嵌合体¹⁷。

●WES的盲区：在WES的100x-200x深度下，若母亲外周血中的突变VAF为2%-5%，测序仪可能仅捕获到2-5条突变读长（Reads）。生物信息学算法通常会将此视为测序错误（Sequencing Error）或背景噪声而过滤掉，从而报告“未检测到变异”。这将导致遗传咨询错误，误认为母亲不携带突变，再发风险低。

●HD-NGS的洞察力：在>1500x的深度下，5%的VAF意味着约75条支持突变的Reads，这在统计学上是一个极其显著的信号，远超背景噪声（通常<0.1%）。HD-NGS能够精确识别低至0.5%-1%的低频变异，从而准确判定母亲的嵌合状态，正确评估再次妊娠生育患儿的风险（该风险可能高达50%） ⁷。

3.2 血管性血友病（VWF）与其它凝血因子的体细胞变异

除了生殖系嵌合，体细胞嵌合体也可能导致表型与基因型的不匹配。

●2N型VWD：有报道显示，某些2N型VWD或轻型血友病患者，其致病变异可能呈现体细胞嵌合状态。例如，肝脏（合成凝血因子的主要器官）可能携带较高比例的突变细胞，而外周血（检测样本）中的比例较低。WES极易漏检外周血中的低频变异，而HD-NGS则能捕捉到这些微弱的遗传痕迹，解释患者“不明原因”的凝血因子活性降低 ²¹。本中心已发现几个病例为体细胞嵌合VWF。

●PROS1缺陷：文献报道了蛋白S缺乏症中的父源嵌合体案例，父亲虽无症状，但其生殖细胞及部分体细胞携带PROS1突变，导致子代患病。HD-NGS对于此类隐匿性遗传来源的排查至关重要 ²²。

深度洞察：在血栓与止血领域，HD-NGS不仅是一种检测技术的升级，更是一种诊断思维的革新。它提示临床医生，阴性的常规检测结果并不代表“无基因异常”，HD-NGS应作为排除低频嵌合体的必要手段。

4. 深部内含子变异（Deep Intronic Variants）：照亮基因组的“暗物质”

WES的设计初衷是捕获编码区（Exome），其探针通常仅覆盖外显子及其侧翼10-20bp的区域。然而，越来越多的证据表明，位于内含子深处的变异通过破坏剪接调控元件（如分支点、增强子）或创造隐蔽剪接位点（Cryptic Splice Sites），导致假外显子（Pseudo-exon）插入，从而引发严重的凝血功能障碍 ²。

4.1 F8基因的深部内含子突变

F8基因极其庞大（186kb），内含子序列极长。WES完全忽略了这些区域。

●致病机制：特定的深部内含子突变，如c.2113+601G>A（内含子13）或c.5220-8563A>G（内含子14），能够激活隐蔽的剪接供体或受体位点，导致一段内含子序列被错误地保留在mRNA中（假外显子），引起移码突变或提前终止 ²⁵。

●HD-NGS解决方案：针对F8的HD-NGS“平铺”探针覆盖关键内含子区域，或者针对已知的深部致病热点进行定点捕获。研究显示，在WES检测阴性的轻/中度血友病A患者中，通过全基因组或针对性内含子测序，可检出约2%-5%的病例为深部内含子变异所致 ²⁷。

4.2 VWF与PROS1的隐匿突变

●VWF：在表型明确为3型VWD但常规外显子测序阴性的患者中，HD-NGS结合RNA分析揭示了如内含子（c.997+118T>G）等深部变异，这些变异破坏了正常的剪接过程，导致蛋白表达完全缺失 ²⁹。

●PROS1：PROS1基因的内含子变异也是蛋白S缺乏症漏诊的重要原因。HD-NGS panel的灵活性允许包含这些非编码区的致病位点，而WES受限于固定的捕获试剂盒，无法灵活添加这些区域 ¹²。

4.3 启动子与调控区变异

除内含子外，基因的启动子区变异也常被WES遗漏。

●血友病B Leyden：由F9启动子区的点突变引起（如c.-20, c.-26等），破坏了雄激素受体（AR）或肝细胞核因子（HNF4α）的结合位点，导致儿童期因子IX水平极低，而青春期后随雄激素水平升高而缓解。WES捕获范围通常不包括转录起始位点上游的启动子区，而HD-NGS panel则将此区域作为F9检测的标配 ³²。

●F7启动子：F7基因启动子多态性（如rs3093230）显著影响FVII的血浆水平，HD-NGS能够完整评估这些调控位点，辅助判断FVII缺乏的临床意义 ³³。

5. 拷贝数变异（CNV）的精准解析：从基因级到外显子级

CNV（大片段缺失或重复）是SERPINC1、PROS1、F8等基因功能丧失的重要机制。WES在CNV检测上存在天然劣势，而HD-NGS通过高深度和均一性覆盖实现了CNV检测的“标准化”。

5.1 均一性带来的分辨率提升

●WES的噪声：WES由于捕获效率在不同外显子间差异巨大（受GC含量、探针亲和力影响），其读深度的变异系数（CV）较大。这使得基于深度比较的CNV算法难以区分真实的“杂合缺失（50%深度下降）”与“捕获效率低下的波动”。通常WES只能可靠地检测涉及3个或更多连续外显子的大CNV ³⁴。

●HD-NGS的精度：HD-NGS经过探针平衡优化，不同外显子间的深度更加均一。在>1500x的深度下，读数统计非常稳健，算法可以敏锐地捕捉到单个外显子（Single-Exon）级别的深度变化（如从1500x降至750x），其灵敏度和特异性均较高 ⁹。

5.2 关键基因的CNV诊断价值

●SERPINC1（抗凝血酶）：抗凝血酶缺乏症I型患者中，大片段缺失较为常见。特别是单外显子缺失（如Exon 1或Exon 6的独立缺失），在WES数据中常被淹没在噪声中，导致漏诊。HD-NGS不仅能检出这些微小CNV，还能通过断点分析识别复杂的结构变异 ³⁷。

●PROS1（蛋白S）：PROS1的大片段缺失也是重要致病原因。由于PROS1P假基因的存在，WES难以准确评估PROS1的拷贝数。HD-NGS通过针对性设计避开假基因干扰，能够准确进行PROS1的剂量分析 ⁴⁰。

●F8与F9：对于血友病携带者，杂合的大片段缺失在常规PCR中无法显示（因为由于X染色体失活或另一条X染色体的掩盖），必须依赖定量的CNV分析。HD-NGS提供的一站式CNV检测能力，避免了后续追加MLPA检测的繁琐和成本 ⁴²。

6. 攻克基因组“雷区”：假基因与高同源序列的解析

血栓与止血相关的241个基因中，包含多个具有高度同源假基因的“困难基因”。WES采用的短读长、通用捕获策略在此类区域极易发生比对错误（Mapping Errors），导致假阴性或假阳性。HD-NGS则通过特殊的实验设计和分析流程解决了这一难题。

6.1 VWF 外显子26-34与假基因 VWFP1

●核心难题：VWF基因的外显子23-34与位于22号染色体上的假基因VWFP1具有高达97%的序列同源性。在WES数据中，源自VWF真基因的Reads常被错误比对到假基因上，或者因多重比对（Multi-mapping）被丢弃，导致外显子26等区域出现覆盖度极低甚至为零的现象（Drop-out）。外显子26是2N型VWD致病突变的热点区域，WES的这一缺陷是致命的 ⁴³。

●HD-NGS解决方案：特异性探针设计，针对真假基因间仅有的少量差异碱基（Paralogous Sequence Variants, PSVs）设计探针，并结合高深度测序数据的单体型分析，实现精准比对。

6.2 PKD1（多囊肾相关）的各种假基因

虽然PKD1主要导致多囊肾，但作为241基因列表中的一员，其与血栓风险及血管结构异常相关。PKD1外显子1-33与6个假基因（PKD1P1-P6）共享98%的同源性。

●WES的无力：WES在PKD1前33个外显子的检测灵敏度仅为约50%，大量变异被漏检或误判 ⁴⁶。

●HD-NGS的应对：必须采用LR-PCR结合HD-NGS，或者采用最新的长读长测序（如PacBio/Nanopore）技术整合到Panel中，才能准确解析这一区域。对于临床诊断，HD-NGS是目前的必选项 ⁴⁸。

6.3 PROS1与PROS1P

●PROS1的外显子1-5与假基因PROS1P高度同源。WES数据在此处常出现比对混乱，导致假阳性变异报告。HD-NGS通过深度测序和PSV分析，能有效区分真假基因，避免误诊 ¹²。

6.4 HBA1 / HBA2（α-地中海贫血）

这两个基因不仅高度同源，还经常发生大片段缺失。WES捕获效率极低且无法准确定量。HD-NGS通过针对性的高深度覆盖下的剂量分析，能够准确诊断α-地贫携带者，这对于解释某些贫血或红细胞增多症至关重要 ⁵¹。

6.5 CFH基因簇（aHUS相关）

CFH与CFHR1-5基因簇存在复杂的同源重组和杂合基因（Hybrid Genes，如CFH::CFHR1）。这种结构变异是aHUS的常见病因。WES难以识别这种融合基因。HD-NGS结合MLPA及结构变异分析算法，能更有效地识别此类复杂变异 ⁵³。

7. 241个基因的综合优势分析

HD-NGS的优势不仅体现在上述通用机制上，更体现在对特定基因的具体临床问题的解决能力上。

7.1 凝血因子类（F8, F9, F7, F12等）

●F8/F9：HD-NGS能解决高达5%的“基因型阴性”血友病患者的诊断问题，这些患者多为深部内含子变异或母亲低频嵌合体。对于F9，HD-NGS能覆盖启动子区，检出血友病B Leyden型突变（WES常漏检启动子） ³²。

●F7：启动子多态性（如rs6046）对FVII活性影响显著，HD-NGS的完整覆盖有助于解释表型与基因型的相关性 ³³。

●F12：HD-NGS的高深度有助于准确识别与HAE-FXII相关的特定缺失突变（p.Phe368_Leu369del）及GOF突变，避免因覆盖不均导致的漏检 ¹。

7.2 抗凝蛋白类（SERPINC1, PROS1, PROC）

●SERPINC1：单外显子缺失是Type I缺陷的重要原因，HD-NGS的CNV分析能力至关重要。此外，启动子区变异（如c.-42-1056G>A）也能被有效捕获 ³⁸。

●PROS1：通过高深度和特异性探针设计，HD-NGS是目前解决PROS1假基因干扰、实现准确分子诊断的首选NGS方法 ⁶¹。

7.3 血小板疾病类（GP1BA, MYH9, ITGA2B, ITGB3）

●GP1BA：该基因含有一个富含串联重复序列（VNTR）的区域（Macroglycopeptide region），WES常导致覆盖度归零或比对错误。HD-NGS配合专门的VNTR分析算法（如adVNTR）及读长策略，能准确解析该区域的变异，这对于诊断Bernard-Soulier综合征和血小板型VWD至关重要 ⁶²。

●MYH9：大基因，突变位点分散。HD-NGS的高覆盖确保了对所有外显子及剪接位点的无死角检测，包括可能导致剪接异常的非经典位点变异。

7.4 TMA与补体类（ADAMTS13, CFH）

●ADAMTS13：由于GC含量高，WES常在Exon 1等区域出现覆盖低谷。HD-NGS通过优化的文库构建保证了全基因的均一覆盖，确保不漏检cTTP致病变异 ¹⁰。

●CFH：HD-NGS结合CNV分析是解析CFH-CFHR1杂合基因及缺失的必要手段，这是aHUS诊断的核心部分 ⁵³。

7.5 药物基因组学与代谢类（VKORC1, CYP2C9, ABCB1）

●这些基因的变异多为SNP，虽然WES能检出，但HD-NGS的高深度提供了更准确的单倍型定相（Phasing）能力，有助于更精准地预测华法林或抗血小板药物的代谢表型 。

8. 临床效用、诊断率与成本效益分析

8.1 诊断率（Diagnostic Yield）

对于表型明确的出血或血栓性疾病，针对性的HD-NGS panel的诊断率通常优于或等同于WES。

●在血友病、VWD等疾病中，由于WES无法检测部内含子变异及部分CNV，其诊断率可能比HD-NGS低约5-10% ⁶⁴。

●单基因病，Targeted Panel的覆盖度显著优于WES，对关键基因的诊断能力更强 ⁶⁶。

8.2 成本与时效

●成本：虽然WES测序成本在下降，但考虑到数据存储、复杂的生物信息学分析（需过滤数万个无关变异）以及对假阳性结果的Sanger验证成本，HD-NGS在特定临床场景下往往更具成本效益 ⁶⁸。

●时效：HD-NGS产生的数据量远小于WES，分析流程更快，报告时间更短，这对于急需确诊以长期指导治疗的患者至关重要（如遗传aHUS）⁶⁸。

8.3 意外发现（Incidental Findings）

WES会产生大量与主诉无关的意外发现（如肿瘤易感基因），这带来了复杂的伦理和遗传咨询问题。HD-NGS仅聚焦于241个相关基因，大大简化了临床报告和咨询流程 ⁷⁰。

9. 结论与建议

综上所述，在血栓与止血遗传病的诊断中，遗传HD-NGS（>1500x）相较于遗传WES（200x）具有技术和临床优势。

1.覆盖完整性：HD-NGS有效解决了WES无法覆盖的深部内含子（F8, VWF）、启动子区（F9, F7）及高GC区域（ADAMTS13）。

2.复杂变异解析：HD-NGS是解析同源假基因（VWF Exon 26, PROS1, PKD1）和特殊重复序列（GP1BA VNTR）的必要手段。

3.灵敏度突破：>1500x的深度使得低频嵌合体（母亲携带者）和微小CNV（单外显子缺失）的检测成为可能，填补了WES的诊断盲区。

建议：对于临床怀疑患有血友病、VWD、血栓性疾病或血小板疾病的患者，首选基于HD-NGS的专病Panel进行检测。WES应仅作为HD-NGS检测阴性后，为了寻找未知新致病基因的二线科研性检测手段。对于241个明确关联的基因，HD-NGS代表了当前分子诊断的最精度与最佳实践。

基于以上讨论，以下为协助临床、患者获益的总结性 PDF,供临床研究者快速查阅、参考斧正