神经毒性是指外源化学物质对神经系统结构和功能造成的损害，可能导致神经元损伤、功能障碍甚至死亡。神经毒性评价是对化合物可能引起的神经系统不良反应的系统性评估，旨在确保化合物安全，预防潜在的中枢和外周神经系统损害，保护公众健康。
不同监管机构对神经毒性测试有不同要求。美国环保局农药项目办公室（USEPA OPP）要求对所有食品用农药进行成人急性和亚慢性神经毒性试验[1]。其他监管机构如国际经济合作与发展组织（OECD）建议首先进行标准毒性测试，这些测试的终点涉及多个器官系统，神经系统亦在其中。若结果显示对神经系统存在潜在影响，则进一步开展神经毒性的专门评估[2]。同样，美国食品药品监督管理局（FDA）2000年发布的《Redbook 2000》也推荐使用分层测试的方法来评估化学品的神经毒性潜力[3]。笔者总结目前神经毒性的评价策略及方法，旨在为化合物以及创新药物研发和安全性评价提供理论依据和实践指导。
1 一般神经毒性评价原则
1.1 神经毒性评价的指导原则
一般神经毒性评价是对化合物可能引起的神经系统损害进行评估，包括急性毒性、慢性毒性以及发育/生殖毒性研究。参考OECD Test Guideline NO.418（OECD TG418）《急性暴露后有机磷物质的迟发性神经毒性》[4]、OECD Test Guideline NO.419（OECD TG419）《有机磷物质的迟发性神经毒性：28天重复剂量研究》[5]、OECD Test Guideline NO.424（OECD TG424）《啮齿类动物神经毒性研究》[6]及OECD Test Guideline NO.426（OECD TG426）《发育神经毒性研究》[7]，以及人用药品注册技术要求协调化国际会议（ICH）发布的指导原则，如S5（R3）《人用药物生殖毒性检测指导原则》[8]，非小分子化合物的生物药也有其专属指导原则——S6（R1）《生物技术衍生药物的临床前安全性评价》[9]，同时适用于人用新化学实体和生物制品的有S7A《人用药品安全药理学试验指导原则》[10]。
这些指导原则详细规定了各种神经毒性测试的实验设计、数据分析和报告要求，为国际间的神经毒性评价提供了标准化参考。研究收集了包括神经系统在内的所有主要器官系统的功能和/或组织病理学评价信息[2]。
OECD TG418采用家鸡模型，通过单次口服给药，核心在于测定给药后24～48 h内脑和脊髓中神经毒性酯酶（NTE）的活性抑制情况，并观察10～20 d后是否出现相应的延迟性临床症状与形态学改变。
OECD TG419作为TG418的补充，侧重于更长期的暴露，通过至少28 d的重复给药，综合评估行为、神经病理学改变及剂量-反应关系。此外，该指南还提供了关于如何根据其他数据（如单次剂量研究、体外筛选测试或结构活性关系）来设定初始剂量的指导。
OECD TG424提供了一个通用的神经毒性框架，可独立进行或与重复剂量毒性研究结合。该指南要求系统记录动物的神经行为学、神经病理学损伤，并可拓展至生化及分子生物学指标。
OECD TG426专注于评估生命早期暴露于化学物质对于子代神经系统发育和功能的潜在影响。该指南强调在发育关键窗口期给药，并全面评估子代神经系统的结构、功能和行为发育。
值得注意的是，基于OECD TG418，衍生出了发育神经毒性（DNT）体外组合实验（IVB），它利用人和啮齿类动物细胞测试多种关键的神经发育过程，为高通量初步筛选提供了工具[11-12]。然而，DNT IVB目前尚不能完全模拟发育中神经系统的复杂特性，也无法代替整体动物实验来最终判定化学物质的人体发育神经毒性。
主要神经毒性评价指导原则对比情况见表1。
1.2 一般神经毒性评价方法
指导原则要求的一般神经毒性评价采用体内评价方法，包括行为学、神经生化、神经电生理、神经影像等方面[13-14]。
行为学评价通过观察实验动物在化合物暴露后的行为变化来评估其对神经系统的影响。评价指标包括运动活性（评估动物的移动频率、速度等以反映其神经系统对运动控制的调节能力）、学习记忆能力（通过迷宫测试、条件反射等方法评估认知功能）、感觉功能（测试触觉、触觉、听觉等感官反应判断感觉系统是否受损）等。
神经生化评价通过定量分析神经组织或体液中的生物分子水平变化来揭示毒性作用靶点与潜在机制。常用技术包括高效液相色谱法（HPLC）、放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。
鉴于神经细胞通过电位传递信息，电生理方法可直接、灵敏地记录神经元的功能状态。神经传导速度显著下降、波幅升高或降低等参数变化均是神经毒性的重要指征。常用于评价的仪器包括脑电图仪、诱发电位仪、神经肌肉传递仪。
神经病理评价通过显微镜直接观察神经系统组织的形态学变化，观察神经元的形态变化，如胞体萎缩、核固缩等，以评估化学物质对神经元的损伤程度；观察神经纤维的形态变化，如脱髓鞘、轴突变性等，以评估化学物质对神经纤维的损伤；观察神经系统组织中的炎症反应，如炎症细胞浸润、水肿等，以评估化学物质对神经系统的炎症反应。
神经毒性评价中重点关注功能观察组合实验（FOB）、运动活动测量和神经病理检查[15]，FOB包含数10种行为指标，用以全面评估神经系统的功能状态。这些指标包括垂直活动、水平活动以及总活动水平（反映动物的整体活跃程度）；惊厥、震颤、重复行为（体现神经系统的异常放电或运动控制障碍）；呼吸模式、步态、排尿（反映自主神经系统的调控功能）等。
1.3 药物神经毒性评价特点
药物神经毒性评价的实验方法与化合物相同，但在一些方面有特殊要求。药物评价需严格遵循药物非临床研究质量管理规范（GLP），并符合ICH相关指南。ICH S5（R3）中提到评估后代的神经功能缺陷，虽不是独立的神经毒性检测，但以整体发育结局为评估重点，是涉及神经系统发育的间接评估[8]。针对生物药的ICH S6（R1）明确在研究药物潜在的不良药理活性时，需在适当动物模型中评估对主要生理系统（包括中枢神经系统）的功能影响[9]。生物制品由于其相对分子质量大、作用机制独特，需结合药物机制、物种特性及临床需求进行“个案分析”[16]。
2分层次神经毒性评价策略
分层测试是必要的，通过初步筛选排除不太可能具有神经毒性的物质，既降低了时间和经济成本，也减少了对实验动物的消耗。
测试的第一阶段，通过设定一系列剂量水平来筛选化学品可能存在的临床或病理的毒性迹象，尤其关注神经系统相关指标。若初筛未发现潜在的神经毒性证据，评估可在此阶段完成，若表现出明确的神经毒性迹象，则进行下一步实验[17]。在后续实验中，重点转向采用更具特异性的终点指标，深入表征神经毒性并有效区分直接神经损伤与间接效应。同时，暴露人群的特殊性（如年龄、性别差异）也被纳入考量。为提高筛选效率，高通量体外测试系统（例如体外细胞分化模型或非啮齿类动物替代模型）被广泛应用，使资源能够集中于高风险化学品[18]。在深入评估层面，一系列精细技术被用于机制探索。例如，免疫组织化学染色可检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以识别星形胶质细胞肥大；神经纤维分离技术有助于观察轴突和髓鞘病变；电子显微镜能揭示亚细胞结构的改变。这些方法为明确神经毒性的作用靶点和机制提供了关键证据[2]。
主要监管机构均支持分层测试理念。OECD《神经毒性试验指导原则》旨在确保获得必要和充分的数据以评估神经毒性风险[2]。《Redbook 2000》推荐采用更详细的组织病理学检查，例如特殊染色[3]。原国家食品药品监督管理总局（CFDA）要求当有其他证据提示潜在安全性担忧时，应进行追加和/或补充的安全药理学研究[19]。
美国环境保护署（EPA）提出采用新的分层测试框架，第一层利用化学结构和高通量实验数据进行危害识别和分组，包括基于转录组测序技术的高通量转录组学（HTTr）和基于高内涵成像的高通量表型分析（HTP）；第二层通过靶向体外测定确认生物靶点或作用机制（MOA）；第三层利用有害结局路径（AOP）框架评估化学物质的潜在不良后果，同时解决现有高通量测序技术的局限性，如扩大测试化学品范围、改进挥发性化学品暴露系统和解决代谢能力问题[20-21]。
3颅内给药的神经毒性评价
颅内注射给药是某些药物安全性和有效性研究的特殊的给药方式，包括鞘内给药、脑实质给药、脑室内给药和硬膜外给药，与传统给药方式相比，颅内注射用药量少，全身暴露量低，直接作用于中枢神经系统（CNS）能绕开血脑屏障，实现快速起效和精准靶向，但也因此带来了局部药物浓度较高、神经毒性风险增大等问题[22]。其非临床神经毒性评价具有技术操作复杂、毒性风险高、免疫反应性等特点。颅内注射需要精确的操作，任何技术失误都可能导致机械损伤、感染或其他并发症，可能干扰对局部给药刺激性的评价[23]。
鞘内注射通过腰椎穿刺将药物注射至蛛网膜下腔使其弥散在脑脊液中[24]。鞘内注射药物的非临床神经毒性评价关注其对神经细胞的毒性及其对神经系统功能的影响。研究鞘内注射药物的局部刺激性是安全性评价的重点，需要对注射部位及周围的腰椎和脊髓进行组织病理学检查及刺激性评价（包括机械性刺激和化学刺激）[23]。鞘内注射药物的药动学研究也是非临床神经毒性评价的一部分，主要研究药物在脑脊液中的分布、代谢及清除特性。
脑实质注射是一种将药物直接注入大脑特定区域（如海马体、纹状体等）的给药方式。在非临床研究中，除了评估药物本身的作用，还需密切关注注射过程可能带来的风险，例如局部出血、感染或神经损伤等。因此，注射后需要仔细观察动物的行为变化，以便评估药物对CNS的影响等[25]。
脑室注射直接将药物注入脑室内，具有分布广泛、靶向性强、效果持久的特点。非临床注射前需通过脑立体定位仪确保精准定位，注射过程中需控制速度以防药物扩散不均或局部组织损伤（如产生血栓）[26]。在小型动物模型中，通常建议累计注射次数不超过5次，以控制由多次穿刺造成的累积损伤[25]。
硬膜外注射是将药物注射到脊柱硬膜外腔的一种方法。评价核心在于药物对硬膜外腔及其邻近神经根和脊髓的刺激性，需要警惕高浓度药物在局部滞留引起的炎症反应、细胞坏死或脱髓鞘等病理改变。长期实验中，应观察结构性变化（如炎症、水肿或瘢痕形成）及其对运动和感觉功能的长期影响[27]。
4神经毒性评价的新技术、新方法
2007年美国国家研究委员会（NRC）发布报告，倡导利用新工具和技术提高毒性测试效率[28]。至2025年，美国FDA宣布将逐步取消单克隆抗体和其他药物的动物实验要求[29]。
4.1体外模型
传统毒性测试存在如成本高、时间长、种属外推不确定等局限。因此，需要更高效、经济且与人类相关性更强的毒性测试方法，以适应大量化学物质评估的需求[18]。这些模型虽尚未被正式纳入指导原则，但已在神经毒性评价中应用多年，其显著优势包括契合3R原则，即减少（reduction）、替代（replacement）、优化（refinement）；能够实现高通量筛选；采用人源细胞规避种属差异；能深入揭示分子机制。
当前常用的体外模型，涵盖单细胞模型与混合细胞模型2种。其中单细胞模型如神经元、胶质细胞培养；混合细胞模型如原代细胞培养、三维（3D）细胞培养[30]。
原代培养神经细胞最能模拟体内生理状态，但培养成本高且稳定性差，适用于实验周期短且对细胞生理代谢功能要求严格的药物筛选。
神经细胞系可用于先导化合物以及环境污染物如重金属等的早期大量筛选。如C6和SH-SY5Y细胞系已被提出作为研究重金属、卤代芳香烃和有机磷酸酯神经毒性细胞机制的敏感实验模型[31]。
神经干细胞具备自我更新能力，可分化为CNS的3种主要组成细胞，能够直接充当毒理学工具评估发育神经毒性[32]。在药物临床前的安全性评价以及毒性机制研究方面，神经干细胞模型极具潜力，有望替代动物实验[33]。应用神经干细胞分化的神经元模型评价抗肿瘤药物的神经毒性，当顺铂浓度＞1 μmol·L−1时，可抑制神经干细胞分化神经元的轴突生长，且抑制程度高于大鼠原代神经元；长春新碱可引起神经干细胞分化神经细胞死亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3/7表达增加[34-35]。
在培养方式上，3D培养技术（如神经球、支架培养）通过模拟细胞间的三维空间互作，能更真实地反映体内微环境，对神经网络功能影响药物（如抗癫痫药）具有更高的检测敏感性。体外模型各有优势和局限性，研究人员可根据实际的需求选择合适的模型进行毒性评价。神经毒性评价中常用体外模型对比情况见表3。
4.2类器官
脑类器官来源于多能干细胞，可以概括脑细胞的组成和功能，虽然没有任何模型可以完全复制人类大脑的复杂性，但基于类器官和类组装体的方法为研究外源性物质对大脑发育和功能的毒理效应提供了强有力的工具[36-37]。
在神经毒性评价中，类器官展现出显著优势。其与人体组织具有高度生理相似性，且具有长期培养、来源广泛、建模时间短等特点[36]。一方面，传统动物模型与人类存在显著的种属差异，尤其对于物种特异性强的生物技术药物，非人灵长类虽更为接近但仍不理想[38]，另一方面，要遵循3R原则，符合动物伦理考量。并且传统的二维模型缺乏细胞的多样性，不能很好地模拟大脑复杂的结构。因此，类器官是更好的选择。
通过将多能干细胞在细胞外基质或悬浮培养中形成的3D聚集体，经过定向诱导分化生成具有特定脑区（如前脑、下丘脑）特征的类器官[39-40]。更进一步，可将不同脑区特性的类器官进行组合，以模拟脑区之间的复杂作用。此外，通过共培养内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞构建的体外血脑屏障模型，为研究药物的中枢渗透性提供了重要工具。
类器官用于神经毒性评价的评价指标包括但不限于神经元细胞死亡，Caspase-3活性作为细胞凋亡的一个指标[41]；线粒体功能和形态的改变[42]；基因表达变化，特别是核因子E2相关因子2（Nrf2）通路相关基因的表达，以及tau蛋白磷酸化[43]。利用hiPSC衍生的脑类器官，研究人员能够系统评估毒性物质对神经元分化、迁移、突触形成以及电活动模式的干扰，从而揭示药物诱导神经毒性的分子和细胞机制[37]。
类器官智能（OI）作为新兴交叉领域，将脑类器官与计算科学相结合，探索其潜在的信息处理与学习记忆能力。通过开环和闭环实验，OI可量化外源性物质对神经可塑性的影响，为DNT测试提供新的视角[40]。脑类器官技术、机器学习和组学数据的结合使大规模筛选神经毒物的平台成为可能[44]。
尽管前景广阔，类器官仍面临挑战。其成熟度尚不足以完全模拟人脑复杂的生理环境[45]。此外，类器官模型通常缺乏功能性的血脑屏障，这可能影响对某些化合物神经毒性的准确评估[46]。
5结语与展望
综上所述，神经毒性评价是确保化学品安全性的关键环节。通过遵循一般和分层次评价原则，综合运用多种体内评价方法，关注鞘内注射药物特殊评价要点，以及积极探索体外模型和类器官等新技术、新方法，能够更全面、精准地评估化学品尤其是药物潜在神经毒性。这不仅有助于保护公众健康，还能减少药物不良反应的发生，推动药物研发进程的优化。但目前神经毒性评价研究仍面临一些挑战，例如，如何标准化3D模型的构建和培养条件，如何实现高通量自动化，以及如何更好地整合多模态数据（如代谢组学、蛋白质组学和电生理活动测量）以全面评估神经毒性，是当前研究的重点。未来结合微生理系统或“器官芯片”技术，将有望创建更复杂的体外模型，以更准确地模拟人体生理功能和毒性响应，进一步提高神经毒性评估的准确性和预测性。随着科学技术的不断进步，相信神经毒性评价将更加完善，为药物研发和临床应用提供更坚实的保障，促进医药领域持续健康发展。
