产业漫谈 | 第14期 CRISPR基因编辑技术发展与应用(上篇)

CRISPR相关基因编辑技术是当前热门的生物工具之一。自2013年以来，CRISPR技术相关研究呈爆发式增长，2020年，艾曼纽·夏彭蒂耶与珍妮弗·道德纳因发现基因技术最锐利的工具之一——CRISPR/Cas9“基因剪刀”荣获诺贝尔化学奖。由于基因编辑可以解决临床前评价体系、新靶标发现、耐药性等问题，而受到广泛关注。本文将阐述CRISPR/Cas9技术的原理、技术优势与局限性、临床应用及产业情况。

基因编辑是一种对基因组序列进行精确修饰的技术，通过基因插入、基因敲除和碱基替换等对基因组靶位点进行一系列的人工修饰，以获得新的功能或表型。传统的基因编辑工具主要包括锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活-效应器核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和聚集的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）。ZFNs、TALENs第一代和第二代基因编辑技术，存在目标识别率低、成本高、脱靶率高、结构复杂及需要设计特定的蛋白识别靶DNA等缺点。2013年，Cell、Science、Nature Biotechnology等杂志接连报道了CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9）基因编辑技术，将靶向基因编辑技术推向高潮。与传统的基因编辑技术相比，该技术具有良好的靶向性、构建简单、可同时操作多条基因等优点，迅速成为生物医学领域的前沿热点，引发了新一轮的基因治疗研究热潮。

CRISPR/Cas是原核生物抵御病毒感染或噬菌体入侵产生的一种适应性免疫系统，其主要通过适应、表达、干扰三个基本阶段来保护细菌免受病毒反复攻击。1987年，CRISPR序列首次被报道；2005年，研究者发现CRISPR中的居间序列并非细菌自身染色体所有，而是与病毒的部分基因组序列高度一致，因此，推测细菌可通过特定方式获取病毒DNA片段并整合到自身CRISPR序列中，当再次遇到相同的入侵者时，细菌可利用这些序列信息进行识别并将其破坏；2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier等人证明CRISPR/Cas9系统可在体外切割双链DNA。2013年，Jennifer Doudna、George Church和张锋分别带领3个研究团队相继证明了CRISPR序列与Cas9蛋白结合后，可在人类细胞中高效地定位、剪切和修改基因组（图1）。此后，CRISPR技术迅速发展，多个具有特定功能的Cas9变异体被鉴定出来。自2016年以来，基于CRISPR的基因编辑技术陆续应用于临床并取得了巨大成功。

图1：CRISPR/Cas技术发展中的主要事件时间表

CRISPR/Cas系统包括三种主要类型（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型），但在实现核酸识别的分子机制上各不相同。与Ⅰ型和Ⅲ型相比，Ⅱ型系统仅依赖于RNA引导的单一蛋白进行特异性的DNA识别和切割，因此，成为最常用的基因组编辑工具。CRISPR/Cas9系统属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统，来源于SF370酿脓链球菌株（streptococcus pyogenes SF370），主要由引导RNA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白组成。Cas9蛋白本质上是一种多域DNA核酸内切酶，负责切割目的基因形成双链断裂，也被称为遗传剪刀。在使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，研究人员把crRNA和反式激活crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）组合起来设计成单个引导RNA（single guide RNA，sgRNA），用来引导Cas9蛋白对对特异靶向DNA进行识别和切割，使DNA双链断裂，产生特异性DNA双链断裂（double strand break，DSB）。DSB形成之后，会经细胞自身的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）对双链断裂进行修复，最终实现目标基因敲除、敲入和碱基编辑等基因组遗传修饰。然而，NHEJ很容易出错，因此，可在DSB形成后，向细胞内导入靶位点的同源序列作为修复模板，然后，进行HDR，实现基因的精准编辑（图2）。

注：左侧为非同源末端连接修复（NHEJ）介导的片段删除/片段插入原理图；中间为同源重组修复（HDR）介导的基因编辑原理图；右侧为微同源末端连接（MMEJ）介导的基因编辑原理图

图2：CRISPR/Cas9基因编辑原理示意图

【参考资料】

1.Li T, Yang Y, Qi H, et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8(1): 36.

2. 彭海航, 靳春鹏. CRISPR/Cas9技术在乙肝治疗中的研究与进展. 中国医药生物技术, 2022, 17(5): 433-439.

3. 程得洛. CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤治疗方面的研究进展. 系统医学, 2020, 5(20): 195-198.

4.庞紫燕, 官阳阳, 孙嘉磊, 等.CRISPR/Cas9基因编辑工具开发与应用研究进展. 生物化工, 2022, 8(5): 140-148.

5. 滕小龙, 史硕博. CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展. 合成生物学, 2023, 4(1): 67-85.

6.博雅辑因、邦耀生物等公司官网.

7.药明康德、生物谷等媒体报道.

往期回顾：

产业漫谈 | 第13期 PROTAC技术及产业进展（下篇）

产业漫谈 | 第12期 PROTAC技术及产业进展（上篇）

产业漫谈 | 第11期：双抗和多抗药物研发进展（下篇）

撰稿：枫林集团、中科院药物所