先进分析技术与行业实践：MS/NMR 深度应用与未来监管展望
从 LC-HRMS 杂质谱到多维 NMR 高阶结构表征，系统呈现 MS 与 NMR 在肽类质量评估中的互补能力，以及工业界真实技术选用更先进分析技术与行业实践：MS/NMR 深度应用与未来监管展望 局。
2026-07 · Journal of Pharmaceutical Investigation · Advanced Analytics & Future Perspectives
10家
参与工业实践调研的药企数量
100%
HPLC 在 DS 鉴别/纯度/含量中的使用率
互补
MS 与 NMR 在肽类 QA 中的核心关先进分析技术与行业实践：MS/NMR 深度应用与未来监管展望 系
CORE INSIGHT
MS 与 NMR 构成肽类质量评估的互补正交分析体系：MS 是高灵敏度通用工具，擅长序列分析与痕量杂质检测；NMR 在结构解析、高阶结构（HOS）与聚集态评估上具有不可替代的独特能力。二者的整合——而非替代——是实现全面、可靠肽类质量评估的关键。
— Fig. 2 MS（A）与 NMR（B）在肽类质量评估中的互补与正交分析能力（原文 Figure 2）
质谱深度应用：从肽图联用 to MS/MS 测序
LC-HRMS 肽图法：长链修饰肽的结构解析利器
Kim et al. (2025c) 利用 LC-HRMS 结合 Glu-C 和糜蛋白酶，开发了利拉鲁肽和司美格鲁肽的肽图方法。两种 GLP-1 类似物均含 31 AA 和脂质链，酶切片段理化性质跨度极大——从短亲水肽到高疏水脂质偶联片段。MS 在方法开发中发挥关键作用：精确测量每个片段的质量，识别缺失片段（尤其是高亲水性片段）。当肽图与 MS/MSE 联用时，可进行详细的序列分析——如司美格鲁肽第 2 位非天然氨基酸 Aib 可通过 b2/b3 离子质量差精确归属。
MS/MS 序列分析：CID 碎裂与 Edman 降解的替代者
碰撞诱导解离（CID）沿肽骨架酰胺键断裂，产生互补的 b 离子（N 端片段）和 y 离子（C 端片段）。通过计算相邻碎片离子的质量差对应单个 AA 残基，实现序列测定。该方法可清晰表征一级结构并鉴定翻译后修饰和化学修饰位点。Kuril et al. (2024a) 对鲑降钙素完成 LC-MS/MS 全序列覆盖测序，证明 MS/MS 测序可在某些情况下补充甚至替代传统肽图法。
LC-HRMS 杂质分析：共流出杂质的「破局者」
Zeng et al. (2015) 建立了经验证的 LC-HRMS 杂质分析方法，覆盖鲑降钙素、比伐芦定和艾塞那肽，质量误差 <10 ppm。关键优势在于：即使比伐芦定与其三种相关杂质色谱共流出，提取离子色谱图（EIC）仍可实现个体成分鉴别。此外，LC-HRMS 定量的总杂质水平显著高于 UV 检测方法，表明其提供了更全面的杂质谱评估。
LIMITATION
MS 的固有局限：无法区分分子量相同的立体异构体（如 D/L-AA）、Leu/Ile 取代杂质、以及 β-丙氨酸相关杂质。这凸显了整合互补分析技术的必要性。
核磁共振深度应用：从序列确认到聚集态评估
多维 NMR 用于短肽序列确认
近期研究展示了 1D/2D NMR 在肽类鉴别中的强大能力。Kuz’mina et al. (2018) 和 Moiseev et al. (2019) 分别利用 ¹H/¹³C-NMR、COSY、HSQC、HMBC 等技术完成了布舍瑞林乙酸酯、曲普瑞林乙酸酯和戈舍瑞林乙酸酯的全信号归属。核心发现：NMR 不仅可确定氨基酸组成，还可通过信号归属实现结构鉴定——即使无直接参比品光谱比对。Menke et al. (2024) 进一步将异核 NMR（HSQC、TOCSY、HMBC）用于奥曲肽乙酸酯的 ¹H/¹³C/¹⁵N 化学位移全归属。
高阶结构与聚集态：NMR 的独特领地
正确的高阶结构（HOS）分析对确保肽类疗效和安全至关重要。Chen et al. (2023) 提出了利用 NMR 数据评估仿制肽 HOS 的建议方案：
1D ¹H NMR：马氏距离 DM < 3.3 作为光谱相似性判定标准
2D ¹³C 异核相关：化学位移差异 Δδ < 15 ppb
2D ¹⁵N 异核相关：Δδ < 8 ppb
²D ¹H DOSY：扩散系数 p 值 >0.05（评估寡聚化）
Hach et al. (2024) 利用 ¹³C-HMQC 评估了三款口服司美格鲁肽仿制药的 HOS：仿制药 OP1 与原研药甲基区信号完全重叠（HOS 一致）；仿制药 OP2 的 AA 21–37 残基信号发生偏移（折叠方式不同），且 NMR 检出配方中含 BPC-157（FDA Category 2 原料药，存在潜在免疫原性风险）；仿制药 OP3 因铬吡啶甲酸存在导致严重信号增宽，司美格鲁肽信号无法观测。
qNMR / HiFSA-qNMR：直接定量与结构辨识一体化
定量 ¹H-NMR（qHNMR）作为直接定量方法日益受到关注。Yu et al. (2018) 以吉西他滨盐酸盐为内标建立了奥曲肽乙酸的 qHNMR 方法并完成验证；Li et al. (2019) 对催产素的比较研究表明：qNMR 的实验室内和实验室间变异度均低于 AAA，与 HPLC 相当或更优。Choules et al. (2019) 进一步提出量子力学迭代全自旋分析（HiFSA）与 qNMR 的组合策略，可同时提供身份确认和纯度信息，并能检测常规 QC 方法难以发现的微量杂质和污染物。
— 图：催产素肽含量测定三种方法的实验室内/间变异度比较（Li et al. 2019）
工业实践调查：10 家药企的技术选用真相
Pack et al. (2025) 基于 10 家聚焦肽类药物（<40 AA）的药企调研，揭示了当前工业界的实际控制策略：
— 图：Pack et al. (2025) 工业调研中各分析技术在 DS/DP 中的使用率统计
HPLC 绝对主导：DS 和 DP 的鉴别、纯度和含量测定中使用率最高（DS 近 100%，DP 约 95%）。
MS 为第二选择：DS 和 DP 鉴别中均为第二常用技术；AAA、MS/MS 测序和肽图常与 MS 联合用于 DS 鉴别。
肽图使用随序列长度增长：>40 AA 肽类的 DS 和 DP 中肽图使用率明显上升。
NMR 的定位：非常规鉴别首选，但频繁用于 DS 结构表征，体现其互补角色。
作为「复杂药物」的合成肽：未竟的协调之路
— Fig. 3 合成肽类药物作为「复杂药物」的特征定位（原文 Figure 3）
合成肽的关键质量属性不仅包括一级结构，还涵盖高阶结构（二级/三级/四级）和寡聚状态。其中寡聚体（Oligomer）尤为重要——它可直接影响疗效且与纤维化密切相关。利拉鲁肽和司美格鲁肽分别被报道以七聚体和三聚体形式存在。
— 图：Table 5 MS 与 NMR 在肽类质量评估中的能力维度对比评分
USP-NF 与 EMA 在 HOS 和寡聚体的处理上存在差异：USP-NF 通则 <1503> 将 HOS 限定于二级和三级结构，寡聚体仅作为肽相关杂质（源于构象变化或肽聚合）考虑；而 EMA 将 HOS 范围扩展至四级结构/缔合态（如寡聚体形式），并将寡聚体视为高分子量（HMW）杂质。
TAKEAWAY
未来监管策略应通过整合先进分析技术与制药工业实践经验来建立——采用分阶段（Phase-appropriate）和逐案（Case-by-case）相结合的方法，以确保稳健而灵活的控制策略。最终目标是建立协调统一的、基于科学的监管框架，以支持高效肽类药质量评估和安全有效肽类治疗药物的开发。
我是 肽硬核TIDES，深耕 TIDES 产业，为你提供涵盖工艺开发、药政法规、知识产权专利与文献解读的硬核产研智库。
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