出处： Wu S, Lu Q, Ding Y, et al. Hyperglycemia-Driven Inhibition of AMP-Activated Protein Kinase α2 Induces Diabetic Cardiomyopathy by Promoting Mitochondria-Associated Endoplasmic Reticulum Membranes In Vivo. Circulation. 2019;139(16):1913-1936.
作者介绍：
Abstract
摘要
背景
Fundc1（FUN14 结构域蛋白 1）是一种线粒体外膜蛋白，对线粒体自噬和线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAMs）具有重要作用。然而，Fundc1 和 MAMs 在糖尿病心脏中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在确定糖尿病诱导的 Fundc1 表达是否会增加 MAM 形成，以及破坏 MAM 形成能否改善糖尿病心脏功能。
方法
研究检测了糖尿病患者和非糖尿病供体心脏中的 FUNDC1 水平；并在高糖处理的小鼠新生心肌细胞〔HG，30 mmol/L D-葡萄糖，48 h〕、链脲佐菌素处理的心肌细胞特异性 Fundc1 敲除小鼠，以及心肌细胞特异性 Fundc1 敲除的糖尿病 Akita 小鼠中，评估Fundc1 诱导的 MAMs、线粒体功能及心脏功能。
结果
与非糖尿病供体相比，糖尿病患者心脏组织中的 FUNDC1 水平显著升高。在培养的小鼠新生心肌细胞中，高糖处理增加了Fundc1、1,4,5-三磷酸肌醇 2 型受体（Ip3r2）及 MAMs 的水平。遗传性下调 Fundc1 或 Ip3r2 均可抑制 MAM 形成，减少内质网—线粒体 Ca²⁺ 通量，并改善高糖处理心肌细胞的线粒体功能。与此一致，在正常糖条件〔5.5 mmol/L D-葡萄糖〕下腺病毒介导的 Fundc1 过表达可促进 MAM 形成、线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍。与非糖尿病对照相比，链脲佐菌素处理小鼠和 Akita 小鼠心脏中的Fundc1、Ip3r2 和 MAMs 水平均显著升高。糖尿病还显著增强 Fundc1 与 Ip3r2 的共免疫沉淀。Fundc1 与 Ip3r2 结合可抑制 Ip3r2 的泛素化及蛋白酶体介导的降解。心肌细胞特异性删除 Fundc1 可消除糖尿病诱导的 MAM 形成，防止线粒体 Ca²⁺ 升高、线粒体碎片化及细胞凋亡，同时改善线粒体功能容量和心脏功能。在小鼠新生心肌细胞中，高糖抑制 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）活性；在 Prkaa2 敲除小鼠的心肌细胞中，Fundc1 表达、MAM 形成及线粒体 Ca²⁺ 水平均显著升高。最后，腺病毒介导的组成型活性 AMPK 突变体过表达可消除高糖诱导的 MAM 形成和线粒体功能障碍。
结论
本研究表明，糖尿病通过抑制 AMPK，启动 Fundc1 介导的 MAM 形成、线粒体功能障碍及心肌病。由 AMPK 介导的 Fundc1 抑制可能成为治疗糖尿病心肌病的有效靶点。
临床视角 本研究的新发现 • 糖尿病可导致心肌细胞中线粒体相关内质网膜异常形成，并引起 Fundc1 表达异常。 • Fundc1 相关 MAMs 增多可导致线粒体 Ca²⁺ 升高、线粒体碎片化和功能障碍，并进一步引起糖尿病心脏功能障碍。 • Fundc1 通过抑制 Ip3r2 的泛素化和蛋白酶体降解，促进糖尿病条件下 MAM 形成。 • AMPKα2 可抑制 Fundc1；糖尿病通过抑制 AMPKα2 活性而增加 Fundc1 表达。 潜在临床意义 • 临床诊断为糖尿病心肌病患者的左心室组织中，FUNDC1 水平高于健康供体心脏，提示 FUNDC1 可能参与人类糖尿病心肌病。 • 激活 AMPK 可抑制心肌细胞中的 FUNDC1 及其相关 MAM 形成。 • 二甲双胍是一种 AMPK 激活剂，主要用于 2 型糖尿病；本研究提示其可能也有助于治疗 1 型糖尿病相关心肌病。 |
Introduction
前言
糖尿病心肌病是糖尿病患者发生心力衰竭和死亡的重要原因。高血糖或高糖（HG）是 1 型糖尿病的重要病理因素，可促进糖尿病心肌病的发生，但其影响相关病理过程的确切机制尚未得到充分阐明。线粒体对细胞能量产生至关重要；然而，线粒体受损后会成为活性氧（ROS）和促凋亡因子的主要来源。越来越多的证据提示，线粒体功能障碍是糖尿病心肌病的核心事件。¹,² 尽管线粒体已被认为参与糖尿病心肌病，但糖尿病损害线粒体功能的分子机制仍不清楚。³–⁶
线粒体和内质网（ER）共同调控多种细胞功能，⁷ 二者之间的结构与功能相互作用对维持细胞稳态至关重要。⁷内质网与线粒体进行信息交流的接触位点被称为线粒体相关内质网膜（MAMs）。⁷ MAMs 富含磷脂和糖鞘脂合成酶及分子伴侣蛋白，其连接由多种分子桥介导。⁸ 例如，1,4,5-三磷酸肌醇受体（Ip3rs）与电压依赖性阴离子选择性通道 1（Vdac1）相互作用，形成内质网—线粒体 Ca²⁺ 通道。⁹ 线粒体外膜蛋白 Mfn2（mitofusin 2，线粒体融合蛋白 2）可与线粒体 Mfn1/2 形成同源或异源复合物，从而将内质网锚定于线粒体。¹⁰ 近期，我们报道了一种新的蛋白质连接桥，即线粒体外膜蛋白 Fundc1（FUN14 结构域蛋白 1）与内质网蛋白 Ip3r2（1,4,5-三磷酸肌醇 2 型受体）之间的相互作用。¹¹ MAMs 在Ca²⁺ 信号、脂质转运、能量代谢和细胞存活中发挥关键作用，¹² 并与阿尔茨海默病、¹³ 癌症、¹⁴ 溶酶体贮积病、¹⁵ 糖尿病、¹⁶,¹⁷ 肥胖诱导的线粒体功能障碍及代谢紊乱¹⁸有关。然而，MAMs 在糖尿病心肌病起始和进展中的作用仍不明确。
Ca²⁺ 信号在肌肉组织兴奋—收缩耦联中发挥关键作用，因此对维持正常心脏功能至关重要；在多种病理状态相关的心力衰竭中，Ca²⁺ 升高均被认为具有重要意义。缺血/再灌注期间，胞质 Ca²⁺ 积聚会引起线粒体 Ca²⁺ 升高，进而激活线粒体基质伴侣蛋白亲环蛋白 D，并触发线粒体通透性转换孔开放，最终导致细胞死亡。¹⁹ 值得注意的是，减少内质网—线粒体连接可防止上述 Ca²⁺ 升高及后续细胞死亡。²⁰ 细胞内 Ca²⁺ 稳态异常已被认为参与糖尿病心脏功能障碍，²¹,²² 但糖尿病扰乱 Ca²⁺ 稳态的确切机制仍不清楚。
Fundc1 是一种高度保守、专一定位于线粒体的蛋白。其含有由 3 个 α 螺旋构成的疏水性跨膜结构域，氨基末端暴露于胞质，羧基末端跨越线粒体膜间隙。Fundc1 含有微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3（Lc3）结合基序，可与 Lc3 相互作用并将线粒体募集至自噬体。²³,²⁴ Fundc1 还可在内质网—线粒体接触位点直接与 Drp1（动力蛋白相关蛋白 1）相互作用，促进线粒体分裂。²⁵ 我们此前的研究表明，Fundc1 对维持 MAM 结构以及保证正常心脏中内质网向线粒体的适度 Ca²⁺ 转运至关重要。¹¹ 此外，心脏特异性删除 Fundc1 会因抑制 MAM 形成而引起心脏功能障碍。¹¹ 然而，Fundc1 相关 MAMs 是否参与糖尿病心肌病仍有待明确。
本研究发现，高糖驱动的 AMPK 失活可增加 Fundc1 稳定性，导致 MAM 异常形成、线粒体 Ca²⁺ 升高、线粒体功能障碍及心脏功能障碍；激活 AMPK 则可通过抑制高糖诱导的 MAM 形成、线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍，逆转糖尿病心肌病。
Results
研究结果
糖尿病心脏中 Fundc1 表达及 MAM 形成增加
为明确糖尿病对 MAMs 的影响，我们首先检测了STZ 诱导糖尿病小鼠心脏中的MAM 相关蛋白。如在线数据补充材料图 IA和 IB 所示，与非糖尿病小鼠相比，糖尿病心脏匀浆中Fundc1、Ip3r2、Pacs-2（磷酸呋喃酸性簇分选蛋白 2）和 Vdac1 水平均显著升高（P<0.05）。另 3 种 MAM 相关蛋白 Sig1r（σ-1 受体）、Mfn2 和 Grp75（葡萄糖调节蛋白 75）在对照和糖尿病心脏间无显著差异；相反，STZ处理心脏中的蛋白二硫键异构酶（Pdi）水平下降。STZ 处理心脏中β-肌球蛋白重链异构体水平升高，提示糖尿病小鼠发生心肌肥大。
随后，我们检测了小鼠心脏分离 MAM 组分中的相关蛋白。在线数据补充材料图 IC证实了 MAM 组分的纯度。与全心匀浆结果一致，STZ 小鼠心脏 MAM 组分中的Fundc1 和 Ip3r2 水平均升高（图 1A）；但Pacs-2、Sig1r、Pdi、Grp75 和 Vdac1 无明显变化。为排除 STZ 作为线粒体毒物所产生的脱靶效应，我们进一步在遗传性糖尿病 Akita 小鼠中检测 MAM 相关蛋白。与 WT 组相比，Akita 小鼠心脏匀浆及心脏 MAM 组分中的 Fundc1 和 Ip3r2 水平均升高（图 1B及在线数据补充材料图 II）。
为验证临床相关性，我们检测了糖尿病患者与非糖尿病供体左心室组织中的 FUNDC1 蛋白。图 1C 显示，糖尿病患者心脏组织中的FUNDC1 水平显著高于非糖尿病供体，证实人类糖尿病心脏中FUNDC1 表达升高。随后通过评价内质网与线粒体的贴近程度分析糖尿病小鼠心脏中的 MAM 形成。透射电镜显示，Akita 小鼠心脏中内质网与线粒体的联系显著增强（图 1D）；定量结果显示，Akita 心脏中邻近线粒体的内质网比例显著升高（图 1E）。
图 1｜1 型糖尿病增强心脏中线粒体相关内质网膜（MAMs）的形成。A，6 月龄载体或 STZ 处理小鼠心脏 MAM 组分中目标蛋白的 Western blot 及灰度定量（均值±SD，每组 n=6–7；*P<0.05 vs 载体）。B，6 月龄 WT 与 Akita 小鼠心脏 MAM 组分中目标蛋白的 Western blot 及定量（均值±SD，每组 n=6–7；*P<0.05 vs WT）。C，供体与糖尿病患者心脏匀浆中目标蛋白的 Western blot 及定量（均值±SD，每组 n=6；*P<0.05 vs 供体）。D，6 月龄 WT 与 Akita 小鼠心肌中内质网和线粒体形态的代表性透射电镜图像；红色星号表示线粒体，蓝色星号表示内质网。E，与线粒体相邻的内质网长度占内质网总长度的比例（均值±SD，每组 n=5–7；*P<0.05 vs WT）。Ip3r2，1,4,5-三磷酸肌醇 2 型受体；MW，分子量。
高血糖促进心肌细胞 MAM 形成及线粒体 Ca²⁺ 升高
高血糖是 1 型糖尿病的重要病理因素。为探讨高糖对MAM 形成的影响，小鼠新生心肌细胞分别接受正常糖〔NG，5.5 mmol/L D-葡萄糖〕、渗透压对照〔5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L D-甘露醇〕或高糖〔HG，30 mmol/L D-葡萄糖〕处理。图 2A、2B及在线数据补充材料图 III 显示，高糖显著增加Fundc1、Ip3r2、Pacs-2 和 Vdac1 水平，而 Pdi、Sig1r、Mfn2 和 Grp75 水平无明显变化。共聚焦成像及Pearson 相关系数分析均显示，高糖处理心肌细胞中内质网与线粒体的关联增强，而正常糖组未见此变化（图 2C、2D）。这些结果提示，高糖可增加心肌细胞 MAM 形成。
随后，我们检测高糖诱导的 MAM 形成是否具有可逆性。高糖处理 48 h 后，将高糖培养基更换为正常糖培养基，并通过活细胞时间序列共聚焦显微镜监测 MAMs。去除高糖 8 h 后，高糖增强的 MAMs 已发生解离，MAM 数量恢复正常（图 2E、2F）。
MAMs可将内质网 Ca²⁺ 储库中的 Ca²⁺ 转运至线粒体。因而，我们进一步判断糖尿病条件下MAM 增多是否会引起线粒体 Ca²⁺ 升高。流式细胞术采用线粒体 Ca²⁺ 指示剂 RPmt 检测，结果显示高糖暴露后线粒体 Ca²⁺ 水平升高；将高糖培养基更换为正常糖培养基 8 h 后，线粒体 Ca²⁺ 恢复至基础水平（图 2G–2J）。
由于 RPmt 对 pH 变化亦具有敏感性，³⁹ 本研究进一步采用 Rhod-2 验证线粒体 Ca²⁺ 变化。鉴于 Rhod-2 也可分布于非线粒体区域，⁴⁰ 研究使用 MitoTracker 共染，并仅对 MitoTracker/Rhod-2 双阳性区域进行定量，同时监测线粒体膜电位（ΔΨm）。高糖处理使ΔΨm 降低而线粒体 Ca²⁺ 升高；将细胞转回正常糖培养 48 h 后，二者均恢复至基础水平。
ΔΨm 与 MPTP 开放密切相关。采用 calcein-Co²⁺ 技术检测 NG、HG、HG+CsA〔MPTP 特异性抑制剂〕及 HG+Ru360〔线粒体 Ca²⁺ 摄取抑制剂〕条件下的 MPTP 开放。高糖显著降低 H9c2 细胞中的 calcein 信号，提示其诱导 MPTP 持续开放；CsA 或 Ru360 可显著阻断该变化，说明高糖通过促进线粒体Ca²⁺ 摄取诱导 MPTP 开放。高糖还降低小鼠新生心肌细胞的ΔΨm，该作用同样可被 CsA 或 Ru360 阻断（图 2K）。进一步分析显示，高糖诱导心肌细胞凋亡，而 CsA 或 Ru360 可消除该效应。综上，高糖通过促进线粒体 Ca²⁺ 摄取，损害线粒体功能、诱导MPTP 开放并触发细胞凋亡。
图 2｜高糖处理小鼠新生心肌细胞中 MAMs 增加。A，正常糖（NG，5.5 mmol/L D-葡萄糖）、渗透压对照（24.5 mmol/L D-甘露醇+5.5 mmol/L D-葡萄糖）或高糖（HG，30 mmol/L D-葡萄糖）处理 48 h 后目标蛋白的 Western blot。B，A 中条带的灰度定量（均值±SD，*P<0.05 vs NG）。C，采用共聚焦显微镜分析内质网（DsRed2-ER）与线粒体（MitoTracker Green）的关联。D，Pearson 系数定量内质网—线粒体接触。E、F，高糖处理 48 h 后换为正常糖培养基，时间序列共聚焦图像及 Pearson 系数定量。G、H，TMRM 染色验证 RPmt 的线粒体定位及腺病毒感染效率。I、J，流式细胞术检测 NG、HG 及去除高糖 8 h（HGR）条件下的线粒体 Ca²⁺。K，TMRM 探针检测 NG 或 HG 处理并加入 DMSO、CsA 或 Ru360 后的ΔΨm。DMSO，二甲基亚砜；MOI，感染复数；RPmt，线粒体靶向比率型 pericam。
Fundc1 过表达促进 MAM 形成、线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍
由于糖尿病或高糖可导致 Fundc1 异常表达，我们检测了Fundc1 过表达对心肌细胞的影响。小鼠新生心肌细胞感染 LacZ 腺病毒（ad-β-Gal）或 Fundc1 腺病毒（ad-Fundc1）48 h 后，检测 MAM 形成和线粒体功能。Fundc1 过表达可升高 MAM 相关蛋白水平，并增加内质网—线粒体接触（图 3A–3C）；在 H9c2 细胞中，Fundc1 过表达同样增加邻近线粒体的内质网比例（图 3D、3E）。MAM 形成增加伴随线粒体功能受损，包括线粒体Ca²⁺ 升高、线粒体 ROS 过度产生、线粒体膜电位下降，以及最大呼吸和储备呼吸容量降低（图 3F–3J）。这些结果提示，Fundc1 上调参与糖尿病心肌病的发生。
图 3｜腺病毒介导的 Fundc1 过表达增加 MAM 形成并诱导小鼠新生心肌细胞线粒体功能障碍。小鼠新生心肌细胞（A–C、F–J）或 H9c2 细胞（D、E）感染 ad-Fundc1或 ad-β-Gal 48 h。A，目标蛋白 Western blot 及定量。B、C，共聚焦图像及 Pearson 系数定量内质网—线粒体接触。D、E，代表性透射电镜图像及与线粒体相邻内质网长度的定量。F、G，RPmt 流式检测线粒体 Ca²⁺。H，MitoSOX 检测 ROS。I，Rh123 检测ΔΨm。J，Seahorse 检测 OCR，并定量最大呼吸和储备呼吸容量（均值±SD，*P<0.05 vs ad-β-Gal）。
糖尿病心脏中内质网—线粒体接触依赖 Fundc1
为明确 Fundc1 是否介导糖尿病条件下的 MAM 形成，我们比较了载体或 STZ 处理的 WT 和 Fundc1 KO 小鼠心脏中的 MAM 相关蛋白。STZ 诱导的糖尿病可增加WT 心脏中的 Ip3r2，但在 Fundc1 KO 心脏中未见该变化（图 4A）。随后构建Fundc1 KO Akita 小鼠（图 4B）。与 WT 心脏相比，Akita 心脏中 Ip3r2 水平显著升高，而 Fundc1 KO Akita 心脏中该升高受到抑制（图 4C）。
进一步通过分析心肌细胞中内质网与线粒体的贴近程度，评价 Fundc1 敲除对 Akita 心脏 MAM 形成的影响。透射电镜显示，Fundc1敲除可减少内质网与线粒体的关联；Akita心脏中该关联显著增强，而Fundc1 敲除可阻断其增强（图 4D、4E）。在培养的小鼠新生心肌细胞中亦得到一致结果：高糖增加 WT细胞中的 Ip3r2 和内质网—线粒体接触，但在 Fundc1 KO 细胞中未见上述增加。说明糖尿病诱导的 MAM 形成需要 Fundc1。
图 4｜心肌细胞特异性 Fundc1 敲除抑制糖尿病诱导的 MAM 形成。A，6 月龄载体或 STZ 处理的 WT 与 Fundc1 KO小鼠心脏匀浆中目标蛋白的 Western blot 及定量。B，Akita 小鼠心肌细胞特异性 Fundc1 删除的基因分型。C，WT、Fundc1 KO、Akita 和 Fundc1 KO Akita 小鼠心脏目标蛋白的 Western blot 及定量。D，4 组小鼠心肌中内质网与线粒体形态的代表性透射电镜图像。E，与线粒体相邻内质网长度的定量（均值±SD；*P<0.05 vs WT；†P<0.05 vs Akita）。
通过心脏 Fundc1 删除破坏 MAMs 可防止糖尿病心脏的线粒体 Ca²⁺ 升高、ROS 过度产生及线粒体功能障碍
鉴于糖尿病增加心脏 Fundc1 表达，且 Fundc1 对心肌细胞 MAM 形成必不可少，我们推测 Fundc1-MAM 轴增强可引起线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍。采用 RPmt 检测心肌细胞特异性 Fundc1 KO Akita 小鼠分离的成年心肌细胞，结果显示 Akita 心脏的线粒体 Ca²⁺ 摄取高于 WT，而 Fundc1 KO 可抑制 Akita 心脏中的线粒体 Ca²⁺ 摄取（图 5A、5B）；Rhod-2 检测得到一致结果。
为探讨糖尿病条件下 Ca²⁺ 摄取与线粒体功能障碍的关系，我们在组胺刺激前后检测 WT、Fundc1 KO、Akita 和 Fundc1 KO Akita 成年心肌细胞的ΔΨm。与 WT 细胞相比，Akita 细胞在组胺刺激后出现更快的线粒体去极化；Ru360可防止 Akita 细胞ΔΨm 崩溃，说明高血糖通过促进线粒体Ca²⁺ 摄取诱导线粒体去极化。Fundc1 KO 和 Fundc1 KO Akita 细胞均可抵御组胺诱导的线粒体去极化。值得注意的是，组胺诱导的线粒体 Ca²⁺ 摄取发生于ΔΨm 下降前约 10 s，提示ΔΨm 是 Ca²⁺ 摄取所必需，而 Ca²⁺ 升高可引起ΔΨm 崩溃。Akita 心脏静息线粒体 Ca²⁺ 水平高于 WT；Fundc1 KO 及 Fundc1 KO Akita 心脏则低于 WT（图 5C–5E）。
流式细胞术显示，分离心脏线粒体的纯度约为 85%，活性约为 80%。Akita 心脏线粒体表现出 ROS 异常增加和膜电位降低，而 Fundc1 KO Akita 心脏的线粒体膜电位明显改善、ROS 产生减少（图 5F–5I）。进一步以 OCR 评价分离线粒体的呼吸能力，Akita线粒体状态 3 和状态 3u 的 OCR 降低，而 Fundc1 删除可大幅挽救该下降（图 5J、5K）。说明 Fundc1 敲除可消除糖尿病驱动的线粒体功能损害。
图 5｜心肌细胞特异性 Fundc1 敲除防止 Akita 心脏线粒体 Ca²⁺ 升高并改善线粒体功能。A、B，组胺刺激后 WT、Fundc1 KO、Akita 和 Fundc1 KO Akita 成年心肌细胞线粒体 Ca²⁺ 摄取时间曲线及峰值定量。C、D，组胺诱导的ΔΨm 变化及去极化时间。E，成年心肌细胞静息线粒体 Ca²⁺ 的共聚焦图像。F–I，分离心脏线粒体中 ROS 与ΔΨm 的流式结果及定量。J、K，Seahorse 测得的线粒体偶联呼吸及各呼吸状态 OCR 定量（均值±SD；*P<0.05 vs WT；†P<0.05 vs Akita）。
心脏 Fundc1 敲除可在体内减轻糖尿病心肌病
为明确 Fundc1 在糖尿病心肌病中的作用，我们以STZ 诱导 WT 和心肌细胞特异性 Fundc1 KO 小鼠发生糖尿病，并于 6 月龄时进行超声心动图检查。WT 小鼠发生 STZ 诱导糖尿病后，左心室内径显著增加，射血分数、短轴缩短率及 E/A 比值下降，等容舒张时间延长，并伴随心肌纤维化增加（表 1及在线数据补充材料图 X）。值得注意的是，与 WT 小鼠相比，Fundc1 KO 小鼠本身也表现为左心室内径增大、射血分数和短轴缩短率下降、E/A 比值降低、等容舒张时间延长及心肌纤维化增加。
然而，心肌细胞特异性删除 Fundc1 几乎完全防止了 STZ 糖尿病小鼠的心脏异常，使左心室内径、射血分数、短轴缩短率、E/A 比值和等容舒张时间恢复正常，并减少心肌纤维化（表 1）。STZ 糖尿病小鼠心重/胫骨长度比值升高，而 Fundc1 KO 完全阻断该变化；TUNEL 染色显示，糖尿病 Fundc1 KO 小鼠的心肌细胞凋亡明显少于糖尿病 WT小鼠。
在心肌细胞特异性 Fundc1 KO Akita 小鼠中，超声心动图进一步验证了上述结果。6 月龄 Fundc1 KO Akita 小鼠未出现糖尿病诱导的心脏异常，其等容舒张时间得到恢复（表 2）。
此外，Fundc1 删除还消除了 Akita 糖尿病小鼠心脏中白细胞介素-6 和肿瘤坏死因子-α的升高。综上，Fundc1 在糖尿病心肌病的发病过程中发挥关键作用。
表 1｜载体或 STZ 处理的 WT 与 Fundc1 KO小鼠超声心动图指标。
指标 | WT+载体 | KO+载体 | WT+STZ | KO+STZ |
EF，% | 66.82±4.27 | 58.93±3.14* | 59.83±3.85* | 65.67±2.81† |
FS，% | 37.43±3.43 | 30.98±2.67* | 32.12±2.73* | 35.76±1.72† |
E/A | 1.95±0.22 | 1.51±0.25* | 1.42±0.21* | 1.87±0.23† |
IVRT，ms | 16.05±0.51 | 21.04±0.72* | 21.38±0.77* | 15.38±0.74† |
IVS;d，mm | 0.68±0.11 | 0.67±0.07 | 0.68±0.13 | 0.70±0.14 |
IVS;s，mm | 0.84±0.12 | 0.87±0.24 | 0.82±0.14 | 0.86±0.21 |
LVID;d，mm | 4.16±0.21 | 4.53±0.27* | 4.48±0.26* | 4.23±0.24† |
LVID;s，mm | 3.14±0.19 | 3.29±0.29* | 3.30±0.38* | 3.21±0.19† |
LVPW;d，mm | 0.63±0.17 | 0.67±0.21 | 0.71±0.21 | 0.79±0.23 |
LVPW;s，mm | 0.80±0.21 | 0.82±0.23 | 0.87±0.24 | 0.90±0.23 |
HR，bpm | 438.73±42.63 | 429.55±17.99 | 455.61±22.78 | 443.39±41.05 |
数据为均值±SD，每组 n=5–8。EF，射血分数；FS，短轴缩短率；IVRT，等容舒张时间；IVS;d/s，舒张末期/收缩末期室间隔厚度；LVID;d/s，舒张末期/收缩末期左心室内径；LVPW;d/s，舒张末期/收缩末期左心室后壁厚度；HR，心率。*P<0.05 vs WT+载体；†P<0.05 vs WT+STZ。
表 2｜WT、Fundc1 KO、Akita 及 Fundc1 KO Akita 小鼠超声心动图指标。
指标 | WT | KO | Akita | KO-Akita |
EF，% | 67.33±5.15 | 56.64±4.17* | 60.14±8.12 | 64.48±7.87 |
FS，% | 37.48±6.26 | 30.31±3.87* | 32.79±5.11 | 34.44±4.47 |
E/A | 1.83±0.28 | 1.27±0.22* | 1.51±0.37 | 1.67±0.31 |
IVRT，ms | 15.18±3.21 | 20.98±4.15* | 20.31±4.32* | 15.79±3.07† |
IVS;d，mm | 0.64±0.11 | 0.71±0.12 | 0.68±0.09 | 0.72±0.12 |
IVS;s，mm | 0.81±0.17 | 0.84±0.16 | 0.91±0.15 | 0.91±0.14 |
LVID;d，mm | 4.11±0.31 | 4.31±0.39* | 4.26±0.48 | 4.29±0.48 |
LVID;s，mm | 3.09±0.28 | 3.36±0.39* | 3.08±0.60 | 3.16±0.42 |
LVPW;d，mm | 0.62±0.17 | 0.69±0.19 | 0.67±0.19 | 0.71±0.22 |
LVPW;s，mm | 0.78±0.19 | 0.80±0.21 | 0.83±0.19 | 0.89±0.21 |
HR，bpm | 433.82±37.24 | 438.54±31.24 | 441.32±36.75 | 448.74±35.66 |
数据为均值±SD，每组 n=6–8。缩写同表 1。*P<0.05 vs WT；†P<0.05 vs Akita。
Fundc1 抑制 Ip3r2 的泛素化及蛋白酶体降解
我们此前发现，Fundc1 可在心脏匀浆中与内质网蛋白Ip3r2 相互作用。¹¹ 因此，本研究检测了糖尿病是否促进二者结合。Akita 心脏中 Fundc1 与 Ip3r2 的共免疫沉淀增加（图 6A），免疫荧光分析也证实了小鼠新生心肌细胞中二者的关联。糖尿病心脏及高糖处理新生心肌细胞中的 Fundc1 和 Itpr2 mRNA 水平均无明显变化；腺病毒介导的 Fundc1 过表达亦不影响 Itpr2 mRNA，提示 Fundc1 可能通过调控降解影响 Ip3r2 蛋白水平。
在对照 siRNA 或 Fundc1 siRNA 处理的小鼠新生心肌细胞中，给予蛋白酶体抑制剂 MG132 或 lactacystin 48 h。MG132 或 lactacystin 均可消除 Fundc1 沉默引起的 Ip3r2 降低；相反，Fundc1 过表达可抑制 Ip3r2 泛素化并提高其稳定性（图 6D、6E）。这些结果表明，Fundc1 抑制 Ip3r2 的泛素化及蛋白酶体降解。
Rnf170是介导 Ip3r2 泛素化的E3 连接酶。⁴² WT 与 Fundc1 KO 心脏中的 Rnf170 蛋白水平相当，提示 Fundc1 并非通过下调 Rnf170 抑制 Ip3r2 降解。Fundc1敲除减少 Ip3r2 与 Fundc1 的结合，同时增加 Ip3r2 与 Rnf170 的结合及 Ip3r2 泛素化；Fundc1 KO Akita 心脏中同样观察到 Ip3r2-Rnf170 结合和Ip3r2 泛素化增加。由此表明，Fundc1与 Ip3r2 的结合可抑制 Ip3r2 泛素化及蛋白酶体介导的降解。
图 6｜Fundc1 抑制 Ip3r2 的泛素化与降解。A，免疫沉淀和 Western blot 检测 6 月龄 WT 与 Akita 心脏中 Ip3r2 与 Fundc1 的相互作用。B，RT-qPCR 检测 WT 与 Akita 心脏中 Itpr2 和 Fundc1 mRNA。C，ad-β-Gal 或 ad-Fundc1感染新生心肌细胞中的 Itpr2 mRNA。D，对照或 Fundc1 siRNA 处理细胞加入不同剂量 MG132 后检测 Ip3r2 和 Fundc1。E，ad-β-Gal 或 ad-Fundc1感染细胞加入环己酰亚胺后检测 Ip3r2 稳定性及多聚泛素化。F，WT、Fundc1 KO、Akita 及 Fundc1 KO Akita 心脏的免疫沉淀结果。G，293T 细胞转染GFP-Fundc1 或 GFP-Fundc1Δ7–48 后检测 Ip3r2 结合与泛素化。H、I，转染GFP-Fundc1 或 GFP-Fundc1Δ7–48 的新生心肌细胞内质网—线粒体接触及 Pearson 系数定量。
Fundc1 氨基末端是其结合 Ip3r2 及形成 MAMs 所必需的
为明确Fundc1 与 Ip3r2 的相互作用方式，我们删除 Fundc1 蛋白胞质侧氨基末端第 7–48 位氨基酸，构建 Fundc1Δ7–48 突变体。该截短突变显著减少 Fundc1 与 Ip3r2 的结合，并伴随 Ip3r2 泛素化增加（图 6G），说明 Fundc1 通过胞质侧氨基末端结构域与 Ip3r2 结合。共聚焦显微镜显示，Fundc1Δ7–48 仍可定位于线粒体，但会减少内质网—线粒体接触（图 6H、6I），提示 Fundc1 氨基末端的 Ip3r2 结合区域对 MAM 形成至关重要。
沉默 Itpr2 破坏 MAMs 可防止高糖驱动的线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍
MAMs的主要功能之一是通过 Ip3rs 调节内质网与线粒体之间的 Ca²⁺ 通量。¹ 为判断减少该通量能否在糖尿病条件下改善线粒体功能并减少凋亡，本研究通过沉默心肌细胞中的 Ip3r2 降低内质网—线粒体 Ca²⁺ 通量。Itpr2 沉默可降低正常糖条件下的线粒体 Ca²⁺ 浓度，并消除高糖诱导的线粒体Ca²⁺ 升高；Rhod-2 检测得到相同结果。此外，Itpr2 沉默减少线粒体 ROS 产生、恢复线粒体膜电位，并改善线粒体最大氧化能力及储备呼吸容量。说明 Ip3r2 介导的内质网—线粒体 Ca²⁺ 转运是高糖诱导线粒体功能障碍的关键环节。
糖尿病抑制心脏 AMPK
AMPKα2 是心肌细胞中主要的 AMPK 亚型，其活性下降是糖尿病心肌病发生的重要事件。⁴³ 二甲双胍持续激活 AMPK 可通过恢复糖尿病 OVE26 小鼠的线粒体和心脏超微结构，预防心肌病。⁴³ 因此，我们检测糖尿病心脏中 AMPK 降低是否参与 MAM 异常形成。通过测定 Thr172 位点磷酸化 AMPK（pAMPK）评价 AMPK 活性，结果显示 STZ 糖尿病心脏中的 pAMPK 显著低于非糖尿病心脏，而 AMPKα2 总蛋白水平无显著差异；pAMPK 下降同时伴随 Fundc1 升高（图 7A、7B）。Akita 小鼠心脏中亦观察到 pAMPK 降低及 Fundc1 升高（图 7C、7D）。
AMPK 抑制与体内外心肌细胞 Fundc1 异常升高相关
为判断 AMPK 活性下降是否促进心脏 Fundc1 上调，我们检测 WT 与Prkaa2〔编码 AMPKα2〕KO 小鼠心脏中的 Fundc1。与 WT 相比，Prkaa2 KO 心脏 Fundc1 蛋白显著升高（图 7E、7F）。共聚焦显微镜进一步显示，Prkaa2 KO 新生心肌细胞中的内质网—线粒体关联显著增强；RPmt 和 Rhod-2 检测均显示其静息线粒体 Ca²⁺ 水平高于 WT 细胞（图 7G–7J及在线数据补充材料图 XIII）。
为建立糖尿病条件下 AMPK 降低与 Fundc1 升高之间的因果联系，我们在高糖处理前、处理中及去除高糖后监测小鼠新生心肌细胞中的 pAMPK 与 Fundc1。与正常糖相比，高糖处理使 pAMPK 降低，同时 Fundc1 和 Ip3r2 升高；去除高糖 8 h 后，pAMPK、Fundc1 和 Ip3r2 均恢复至基础水平（图 7K、7L）。
图 7｜糖尿病通过下调 AMPK 增加 Fundc1。A–D，载体/STZ 小鼠及 WT/Akita 小鼠心脏中 pAMPK、AMPKα2、Fundc1 等蛋白的 Western blot 与定量。E、F，WT 与 Prkaa2 KO 小鼠心脏目标蛋白及定量。G、H，WT 与 Prkaa2 KO 新生心肌细胞内质网—线粒体接触及 Pearson 系数定量。I、J，RPmt 流式检测线粒体 Ca²⁺。K、L，NG、甘露醇、HG 以及去除高糖后不同时间点的 pAMPK、Fundc1 和 Ip3r2。M–P，ad-β-Gal 或 ad-AMPK-CA 感染并接受 NG/HG 处理的心肌细胞中目标蛋白、MAM 接触、线粒体 Ca²⁺ 及 ΔΨm。数据以均值±SD 表示；*P<0.05 vs 相应对照；†P<0.05 vs ad-β-Gal+HG。
AMPK 可防止培养小鼠新生心肌细胞中高糖诱导的 Fundc1、MAMs 及线粒体 Ca²⁺ 升高
正常糖或高糖处理的小鼠新生心肌细胞感染 ad-β-Gal 或组成型活性 AMPK 突变体腺病毒（ad-AMPK-CA）。AMPK 激活可消除高糖诱导的 Fundc1 表达（图 7M），抑制高糖诱导的 MAM 形成（图 7N），并防止线粒体 Ca²⁺ 升高和线粒体去极化（图 7O、7P）；Rhod-2 检测同样证实 AMPK 激活可防止高糖诱导的线粒体 Ca²⁺ 升高。综上，高糖通过下调 AMPK，增加 Fundc1、Fundc1 介导的 MAMs 及糖尿病心脏中的线粒体 Ca²⁺。
Discussion
讨论
本研究首次报道，糖尿病介导的 MAM 形成可引起异常 Ca²⁺ 信号，继而导致糖尿病相关线粒体功能障碍和心肌病（在线数据补充材料图 XIV）。通过遗传性删除 Fundc1 破坏心肌细胞 MAMs，可消除糖尿病小鼠的线粒体Ca²⁺ 升高、线粒体功能障碍及心脏功能障碍。研究发现，Fundc1与 Ip3r2 相互作用，并抑制 Ip3r2 的泛素化和蛋白酶体降解；Prkaa2 KO 小鼠表现为 Fundc1 增加及线粒体 Ca²⁺ 升高；持续激活心肌细胞AMPK 则可防止高糖诱导的 MAM 形成、线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍。因此，高糖诱导的AMPK 抑制可通过增加 Fundc1、Fundc1 相关 MAMs 及心脏线粒体 Ca²⁺，导致糖尿病心肌病。
本研究最重要的发现是，糖尿病诱导的 Fundc1 参与糖尿病心肌病的发病过程。心肌细胞特异性删除Fundc1 可改善糖尿病小鼠线粒体功能并减轻心肌病，证实Fundc1 在该病中的因果作用。多项证据表明，Fundc1是介导糖尿病诱导 MAM 形成及线粒体 Ca²⁺ 升高的重要分子，并揭示了糖尿病线粒体功能障碍的新机制。第一，高血糖增加 MAM 相关 Fundc1，并增强其与内质网蛋白 Ip3r2 的结合，进而增加线粒体Ca²⁺ 摄取，导致线粒体 Ca²⁺ 升高及功能障碍。第二，Fundc1 与 Ip3r2 相互作用并抑制其泛素化及蛋白酶体降解。第三，糖尿病促进内质网与线粒体关联，并增加 MAM 中 Ip3r2 丰度。第四，遗传性删除 Fundc1 降低 Ip3r2 丰度并减少线粒体—内质网接触。第五，Fundc1 调控糖尿病相关 MAM 功能，导致线粒体 Ca²⁺ 升高和线粒体功能障碍。最后，心肌细胞中 Fundc1 过表达可诱导类似糖尿病的表型，包括MAM 形成增加、线粒体 Ca²⁺ 升高及线粒体功能障碍。这些结果与既往研究一致，即线粒体结构与功能异常是糖尿病心肌病发病机制中的核心事件。¹
多种病理条件下MAM 形成增强可启动线粒体 Ca²⁺ 升高，并导致线粒体功能障碍。⁴⁴ 例如，删除与Vdac1-Ip3r1 连接桥相互作用的重要分子亲环蛋白 D，可减少线粒体—内质网相互作用，并通过降低线粒体 Ca²⁺ 升高保护心肌细胞免受致死性缺氧—复氧损伤。²⁰ 本研究的重要观察结果是，Fundc1通过增加 MAMs 促进 Ca²⁺ 升高和线粒体功能障碍。糖尿病心脏MAM 组分中，仅 Fundc1 和 Ip3r2 两种 MAM 相关蛋白明显升高，并且二者相互作用增强。这与既往关于 MAMs 对线粒体 Ca²⁺ 稳态至关重要的研究结果一致。¹²
本研究首次揭示了心肌细胞中AMPK 与 MAMs 之间的新联系。至少在心脏中，AMPK 似乎是 MAMs 的重要调控因子；AMPK 失调可通过造成 Fundc1 相关 MAM 数量异常而参与糖尿病心肌病。支持证据包括：与 WT心脏相比，Prkaa2 缺失心脏的 MAM 形成及线粒体 Ca²⁺ 水平均显著增加；糖尿病心脏的 AMPK 活性降低而 MAM 形成增强；持续激活高糖处理的小鼠新生心肌细胞 AMPK 可抑制 MAM 形成及线粒体 Ca²⁺ 升高。
二甲双胍是临床最常用的 2 型糖尿病治疗药物之一，也是经典的AMPK 激活剂。⁴³,⁴⁵–⁴⁷ 英国前瞻性糖尿病研究显示，二甲双胍激活 AMPK 可改善肥胖糖尿病患者的心脏功能并降低心肌梗死发生率。⁴⁸ 我们既往研究也表明，二甲双胍诱导的 AMPK 持续激活可通过恢复糖尿病OVE26 小鼠的线粒体及心脏超微结构预防心肌病。⁴³ 本研究进一步支持这样一种观点：主要用于 2 型糖尿病的二甲双胍，可能也可用于治疗 1 型糖尿病相关心肌病。未来需要更大规模的临床试验评价二甲双胍对 1 型糖尿病患者心血管结局的潜在影响。
精确调控线粒体分裂与融合对维持正常心脏功能至关重要，因为过度融合和过度分裂均可损害心脏。例如，心脏特异性 Dnm1L〔编码 Drp1〕KO 小鼠可发生左心室功能障碍，其前期表现为线粒体延长和线粒体功能障碍。⁴⁹ 此外，心脏 Mfn1 和 Mfn2 删除会抑制线粒体融合并同时引起心脏功能障碍。⁵⁰ 本研究发现，糖尿病增加线粒体分裂蛋白 Fis1 表达，诱导过度线粒体分裂并损害心脏结构和功能；相反，Fundc1 KO 小鼠中 Fis1 表达降低，导致线粒体过度融合及心脏功能障碍。¹¹ 值得注意的是，在糖尿病心肌细胞中，Fundc1删除可通过抑制 Fis1 表达恢复正常线粒体形态，进而改善心脏结构和功能。
心肌细胞中Fundc1 水平与 MAM 水平密切相关。定位于 MAMs 的 Fundc1 与 Ip3r2 结合，介导 Ip3rs 依赖的内质网 Ca²⁺ 向线粒体和胞质释放。正常条件下，心肌细胞Fundc1 删除会因降低线粒体 Ca²⁺ 和线粒体分裂而诱发心脏功能障碍和心力衰竭；而在糖尿病条件下，异常升高的 Fundc1 及 Fundc1 相关 MAMs 会导致线粒体 Ca²⁺ 过度升高。过量线粒体 Ca²⁺ 可通过线粒体碎片化、OCR 降低、MPTP 持续开放及细胞凋亡等多种方式损害线粒体功能。Fundc1删除可一致地防止高糖诱导的上述变化。因此，Fundc1删除可通过破坏 MAMs 及 MAM 相关线粒体 Ca²⁺ 升高，改善或预防糖尿病心肌病。
Fundc1对维持正常心脏功能必不可少，但在胰岛素抵抗或糖尿病等应激条件下过度升高则可引起心肌病。类似现象也见于其他心脏稳态调节蛋白。例如，在成年心脏中，叉头框蛋白 O1（FoxO1）对维持心肌细胞稳态十分重要；⁵¹,⁵² 但在糖尿病和胰岛素抵抗状态下，FoxO1因应激而过度表达或过度激活，可触发糖尿病心肌病。⁵³,⁵⁴
Akita小鼠是经过充分验证的、非肥胖型人类 1 型糖尿病模型，同时不受 STZ 给药潜在混杂效应影响。⁵⁵,⁵⁶ Akita 小鼠和 STZ 糖尿病小鼠均常用于糖尿病心肌病研究，但二者在部分功能、结构及代谢异常方面存在差异。⁵⁷,⁵⁸ Akita 小鼠主要表现为收缩功能保留的舒张功能障碍，STZ 小鼠则兼有舒张和收缩功能障碍；Akita小鼠通常无心肌肥大和纤维化，而STZ 糖尿病小鼠二者兼有。本研究结果与既往报道一致。二者差异可能与高血糖诱导方式不同有关：Akita 小鼠因遗传改变而长期持续高血糖，STZ小鼠则在给药后出现较急性的血糖升高。尽管如此，Fundc1 KO 均可减轻 Akita 和 STZ 心脏异常，支持 Fundc1 基因删除能够保护糖尿病心肌病这一主要结论。
Fundc1可与 Lc3 相互作用并作为线粒体自噬受体。²³,²⁴ 尽管糖尿病显著增加 Fundc1 水平，本研究并未观察到糖尿病条件下线粒体自噬增强。需要注意的是，通过自噬清除受损线粒体不仅需要线粒体自噬受体，还需要整体自噬的诱导以及 PINK1-Parkin 通路的激活，从而使受损线粒体获得选择性自噬识别。⁵⁹ 糖尿病心脏中整体自噬受到抑制，PINK1和 Parkin 蛋白减少，并伴随溶酶体相关膜蛋白 1（Lamp1）表达下降。⁶⁰ 因而，在糖尿病条件下，仅上调线粒体自噬受体Fundc1 并不足以诱导线粒体自噬。线粒体自噬缺陷会导致受损线粒体积聚，释放 ROS 和促凋亡因子，最终损害心脏结构和功能。
线粒体 Ca²⁺ 信号可调控细胞代谢，以及坏死、凋亡和自噬等细胞死亡过程。⁶¹ 例如，线粒体 Ca²⁺ 的短暂波动可激活基质中的丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶，并促进氧化磷酸化和ATP 产生。⁶² 相应地，同时删除 3 种 Ip3rs 会降低线粒体 Ca²⁺ 摄取并损害线粒体功能。⁶³ 此外，缺血—再灌注损伤时线粒体 Ca²⁺ 升高与心肌细胞凋亡相关。⁶⁴,⁶⁵ 这些证据表明，维持适当的内质网—线粒体 Ca²⁺ 通量，对线粒体和代谢稳态至关重要。与此一致，在高糖培养的心肌细胞中，下调 Ip3r2 等参与内质网—线粒体关联和 Ca²⁺ 通量的关键分子，可改善线粒体呼吸、抑制氧化应激并减少细胞凋亡；Fundc1 缺失心肌细胞中因内质网—线粒体接触被破坏，也观察到类似结果。更重要的是，心脏特异性删除 Fundc1 可减轻糖尿病小鼠线粒体功能障碍、心肌细胞凋亡及心脏功能障碍。这些结果进一步支持线粒体 Ca²⁺ 稳态对维持正常心脏结构和功能的重要性。
通过线粒体钙单向转运体进行的 Ca²⁺ 摄取依赖ΔΨm。⁶⁶ 过量进入线粒体的 Ca²⁺ 可因正电荷进入直接降低ΔΨm，⁶⁷,⁶⁸ 或通过触发 MPTP 持续开放间接降低ΔΨm。⁶⁵ 在线粒体 Ca²⁺ 摄取之后，Na⁺/Ca²⁺ 交换器 NCLX 介导 Ca²⁺ 排出。ΔΨm 下降时线粒体 Ca²⁺ 外排会停止，但ΔΨm 崩溃如何影响 Ca²⁺ 外排仍不明确。在心脏及其他多种哺乳动物组织中，NCLX是线粒体基质 Ca²⁺ 外排的主要通路。⁶⁹ Palty 等⁷⁰发现，NCLX 过表达可增强线粒体 Ca²⁺ 外排，而无活性 NCLX 突变体过表达会抑制该过程。
值得注意的是，糖尿病心肌细胞中线粒体 Ca²⁺ 升高与低ΔΨm 并存，提示高糖不仅通过增强 MAM 形成促进线粒体 Ca²⁺ 摄取，也可能抑制线粒体 Ca²⁺ 外排。本研究结果与既往观察一致，即去极化线粒体在激动剂刺激后仍维持较高线粒体 Ca²⁺。⁷¹ 棕榈酸处理的 H9c2 细胞中也可同时观察到低ΔΨm 与线粒体 Ca²⁺ 升高。⁷² 此外，原代β细胞中，沉默编码 NCLX 的 Slc8b1 可显著抑制高糖诱导线粒体Ca²⁺ 摄取后的 Ca²⁺ 外排。⁷³ 糖尿病如何损害心肌细胞线粒体Ca²⁺ 外排，仍需进一步研究。
由于现有探针均存在局限，精确测定线粒体 Ca²⁺ 极具挑战。本研究采用 RPmt³³,³⁴ 和 Rhod-2⁷⁴ 两种方法检测线粒体 Ca²⁺。RPmt 因具有专一线粒体定位和比率测量特性，可避免负载不均，是研究较充分的线粒体 Ca²⁺ 指示剂；但 RPmt 不仅对 Ca²⁺ 变化敏感，也会受到 pH 影响。³⁹ Rhod-2 同样被广泛用于细胞内 Ca²⁺ 检测，其主要局限是可负载于线粒体以外的区域，如细胞核。⁴⁰,⁷⁵ 为减少脱靶影响，本研究使用MitoTracker 共染线粒体，并在共聚焦图像中定量Rhod-2/MitoTracker 双阳性信号。RPmt与 Rhod-2 得到的结果相似，支持糖尿病可能导致线粒体 Ca²⁺ 升高。由于缺乏能够精确测量线粒体 pH的特异性方法，无法完全排除所测RPmt 信号来自线粒体 pH 变化的可能性。虽然这种可能性较低，但线粒体 pH 改变仍可能影响两种探针的荧光强度。
综上，本研究发现 Fundc1 在糖尿病诱导 MAM 形成及继发线粒体 Ca²⁺ 升高中具有新的作用。线粒体Ca²⁺ 升高可损害线粒体功能，并进一步破坏心脏结构与功能。糖尿病很可能通过下调 AMPK 诱导 MAM 形成；激活 AMPK 则可能通过下调 Fundc1 及 Fundc1 相关 MAMs，为糖尿病心肌病提供新的治疗途径。
Methods
研究材料与方法
数据共享
为便于其他研究者重复研究结果或复制实验流程，本研究的数据、分析方法和研究材料可通过联系通讯作者获得。
人心脏样本
研究检测了临床诊断为糖尿病心肌病患者（心脏受者）及健康人供体心脏左心室组织中的 FUNDC1 表达。所有人体研究均经华中科技大学同济医学院附属协和医院人体伦理委员会批准（2017-S10005），受试者均签署知情同意书。患者特征见在线数据补充材料表 I。
动物研究伦理
本研究动物实验方案经乔治亚州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
心肌细胞特异性 Fundc1 敲除 Akita 小鼠的构建
携带 floxed Fundc1 基因（位于 X 染色体）的小鼠由加州大学戴维斯分校 Mouse Biology Program 构建。C57BL/6J 野生型（WT）小鼠、CreαMyHC⁺/⁻ 小鼠及糖尿病杂合 Akita（Ins2wt/C96Y）小鼠²⁶购自 Jackson Laboratory。CreαMyHC⁺/⁻ 等位基因可在心脏特异性α-肌球蛋白重链（αMyHC）启动子控制下，使 Cre 重组酶特异性表达于心肌细胞。将 Fundc1wt/f/CreαMyHC⁺/⁻ 与 Fundc1wt/Y/CreαMyHC⁺/⁻ 小鼠交配，获得心肌细胞特异性 Fundc1 敲除小鼠〔KO；Fundc1f/Y/CreαMyHC⁺/⁻〕；同窝 Fundc1wt/Y/CreαMyHC⁺/⁻ 小鼠作为对照。将雄性杂合 Akita（Ins2wt/C96Y）小鼠与雌性Fundc1f/f/CreαMyHC⁺/⁻ 小鼠交配，获得 Fundc1 KO Akita 双突变小鼠〔Fundc1f/Y/CreαMyHC⁺/⁻/Ins2wt/C96Y〕。所有小鼠均维持于 C57BL/6J 遗传背景，在温度受控、12 h 明暗周期条件下饲养，自由摄食和饮水。实验使用 6 月龄小鼠；Akita 小鼠购自 Jackson Laboratory，并使用 6 月龄雄性小鼠进行实验。
Nnt 突变筛查
烟酰胺核苷酸转氢酶（Nnt）突变会影响线粒体氧化还原状态，进而可能影响线粒体功能。²⁷,²⁸ 本研究采用聚合酶链式反应检测所有实验小鼠品系中的 Nnt 突变，包括同窝 WT、Fundc1 KO、Akita、Fundc1 KO-Akita，以及另一组同窝 WT 和 Prkaa2 KO 小鼠。为排除 Nnt 突变对结果的潜在影响，所有携带 Nnt 突变的小鼠均被排除。
糖尿病模型诱导
按照糖尿病并发症动物模型联盟发布的“小鼠低剂量链脲佐菌素诱导方案”建立 1 型糖尿病模型。简而言之，对 8 周龄Fundc1wt/Y/CreαMyHC⁺/⁻（WT）及 Fundc1f/Y/CreαMyHC⁺/⁻（KO）小鼠连续 5 d 每日腹腔注射链脲佐菌素（STZ；Sigma-Aldrich，50 mg/kg，溶于 pH 4.5 的柠檬酸缓冲液）。对照小鼠注射柠檬酸缓冲液。注射后 2 周测定血糖，仅将血糖 >350 mg/dL 的动物判定为糖尿病。糖尿病诱导后 4 个月进行实验。
超声心动图
采用 Vevo 3100 高分辨率微型超声系统（FUJIFILM VisualSonics）评价小鼠心脏几何结构与功能。小鼠以 1.5% 异氟烷麻醉，仰卧置于加热平台上，在乳头肌水平获取左心室短轴二维图像。根据收缩末期和舒张末期左心室尺寸，计算左心室内径、左心室后壁厚度、短轴缩短率和射血分数。采用经二尖瓣多普勒测定左心室舒张早期充盈速度（E 波）与心房收缩期充盈速度（A 波）的比值（E/A），评价舒张功能。为避免偏倚，所有超声数据采集和分析均由不知晓实验处理的研究者完成。
细胞培养
使用原代心肌细胞分离试剂盒（#88281，Thermo Fisher Scientific）从出生 1–3 d 的小鼠中分离新生心肌细胞。新鲜心脏剪碎后与分离酶孵育 35 min，随后用 Hank 平衡盐溶液清洗 2 次。组织置于原代细胞分离专用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（#88287，Thermo Fisher Scientific）中，培养基含 10% 胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）及心肌细胞生长补充物（按厂家建议 1:1000 稀释）；使用 1000 μL 枪头上下吹打 25–30 次，制备单细胞悬液。采用 TC20 自动细胞计数仪（Bio-Rad）测定细胞总数，并以台盼蓝排除法评价细胞活力。分离的心肌细胞维持于含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中。
成年心肌细胞按既往报道的方法²⁹从雌性 C57BL/6J 小鼠中分离。小鼠经腹腔注射戊巴比妥麻醉后迅速取心，经升主动脉插管并安装于改良 Langendorff 灌流系统。心脏在 37°C 下以含 II 型胶原酶（Worthington）和透明质酸酶（Sigma）的氧合 Krebs-Henseleit 缓冲液灌流。收集杆状成年心肌细胞，以 2×10⁴ 个/盖玻片接种于层粘连蛋白包被的盖玻片上，在无血清 M199 培养基中培养不超过 3 d；培养基含 10 mmol/L 谷胱甘肽、26.2 mmol/L 碳酸氢钠、0.02% 牛血清白蛋白及 50 U/mL 青霉素-链霉素。
大鼠 H9c2 心肌母细胞（ATCC CRL-1446）购自 American Type Culture Collection，采用含 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（#11885，Thermo Fisher Scientific）培养，并置于 37°C、5% CO₂/95% 空气的湿润环境中。所有培养基均补充青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）。
质粒转染、基因沉默及腺病毒感染
DsRed2-ER 质粒（#632409）购自 Clontech Laboratories。采用 QuikChange II 定点突变试剂盒（Agilent，#200523）在 GFP-Fundc1 质粒（Origene，RG208211）基础上删除第 7–48 位氨基酸，构建 GFP-Fundc1Δ7–48 突变质粒，并使用 T7 引物测序确认。心肌细胞使用 Lipofectamine 2000（#11668-019，Life Technologies）按厂家说明进行质粒转染。
Fundc1 小干扰 RNA（siRNA；#sc-145273）购自 Santa Cruz Biotechnology，Itpr2 siRNA（#n435663）购自 Life Technologies。使用 Lipofectamine RNAiMAX（#13778150，Life Technologies）按厂家说明，以 10 μmol/L siRNA 沉默心肌细胞中的 Fundc1 或 Itpr2。
小鼠新生心肌细胞或 H9c2 细胞在常规培养基中感染编码 Fundc1 的腺病毒（#197503A 和 #281786A，Applied Biological Materials）48 h；编码 β-半乳糖苷酶的腺病毒载体（ad-β-Gal；#000197A）作为对照。编码组成型活性 AMPK 突变体的腺病毒（ad-AMPK-CA）按既往方法构建。³⁰
免疫沉淀与 Western blot
培养的心肌细胞及全心组织使用放射免疫沉淀分析裂解液（#sc-24948，Santa Cruz Biotechnology）匀浆。裂解液含 200 mmol/L 苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制剂混合物及去污剂〔离子型去污剂十二烷基硫酸钠、100 mmol/L 脱氧胆酸钠，以及非离子型去污剂 Nonidet P-40〕。采用双辛可宁酸法（#23225，Pierce）测定蛋白浓度。总细胞裂解物以特异性抗体进行免疫沉淀，沉淀物随后行 Western blot。Western blot 中取 40–80 μg 蛋白进行 SDS-PAGE，转移至硝酸纤维素膜，并以特异性抗体孵育。信号使用 Amersham Imager 680 显影，条带强度〔面积×密度〕采用 ImageQuant TL 8.2 软件测定并扣除背景。
使用的一抗包括：抗 FUNDC1（#NBP1-81063，Novus；#ABC506，EMD Millipore）、抗 IP3R2（#ab55981，Abcam；#sc-398434，Santa Cruz）、抗 PACS2（#19508-1-AP，Proteintech）、抗 Sig1r（#42-3300，Thermo Fisher Scientific）、抗 MFN2（#sc-50331，Santa Cruz）、抗 PDI（#2446，Cell Signaling Technology）、抗 GRP75（#2816，Cell Signaling Technology）、抗 VDAC1（#4661，Cell Signaling Technology）、抗钙网蛋白（#ab39818，Abcam）、抗 β-微管蛋白（#AC02，ABclonal）、抗 GAPDH（#sc-137179，Santa Cruz）、抗泛素（#sc-8017，Santa Cruz）、抗 RNF170（#ab80435，Abcam）、抗 β-肌动蛋白（#sc-47778，Santa Cruz）、抗磷酸化 AMPKα（Thr172；#2535，Cell Signaling Technology）、抗 AMPKα2（#sc-19131，Santa Cruz）、抗磷酸化 ACC（Ser79；#3661，Cell Signaling Technology）、抗 β-MHC（#22280-1-AP，Proteintech）、抗肿瘤坏死因子-α（#sc-1351，Santa Cruz）及抗白细胞介素-6（#sc-12912，Cell Signaling Technology）。
亚细胞分级
心脏亚细胞分级按照已发表的方法进行。³¹
心脏线粒体分离
用于流式细胞术分析的线粒体采用线粒体分离试剂盒（#89801，Thermo Fisher Scientific）分离。每个心脏以 2 mL PBS 清洗 2 次后弃去 PBS，将组织剪成 <1×1×1 mm³ 的小块，在冰上以 0.3 mg/mL 胰蛋白酶/PBS 孵育 3 min，随后于 4°C、250g 离心 1 min，使组织沉淀并去除胰蛋白酶。加入 800 μL 含蛋白酶抑制剂的 4 mg/mL 牛血清白蛋白/试剂 A，在冰上进行 Dounce 匀浆；随后加入 800 μL 含蛋白酶抑制剂的试剂 C，倒置混匀。样本于 4°C、700g 离心 10 min，弃去沉淀；上清再于 4°C、3000g 离心 15 min。向线粒体沉淀中加入 500 μL 清洗缓冲液〔试剂 C 与等体积超纯水混合〕，再以 12000g 离心 5 min，沉淀置冰上用于后续实验。超纯水由 Milli-Q Reference 系统制备，在 25°C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm，总有机碳 ≤5 ppb。分离线粒体的纯度与活性通过 MitoTracker Green 和 TMRM 双染后进行流式细胞术评价。
免疫荧光
细胞以 PBS 清洗 2 次，使用 PBS 中 3.7% 多聚甲醛固定 15 min，以 0.2% Triton X-100 透化 15 min。随后用 5% 正常山羊血清封闭 30 min，在 37°C 下与一抗（1:200）孵育 30 min，再与 Alexa Fluor 488 或 647 偶联二抗（1:50，Life Technologies）于 37°C 孵育 45 min。盖玻片使用抗淬灭封片剂封片并密封，采用 LSM800 共聚焦显微镜（Carl Zeiss）采集图像。
内质网—线粒体接触分析
细胞转染 DsRed2-ER 质粒 48 h，再以 MitoTracker Green FM（250 nm；Ex/Em 490/516 nm）在 37°C 染色 30 min，并使用 LSM800 共聚焦显微镜观察。通过 Z-stack 程序采集经三维反卷积处理的图像堆栈，用于分析内质网与线粒体共定位。采用 Pearson 相关系数³²量化 DsRed2-ER 与 MitoTracker Green 荧光信号的重叠程度，分析使用 ZEN 软件内置共定位模块，并以单标记对照确定阈值。
线粒体 Ca²⁺ 测定
活细胞线粒体 Ca²⁺ 水平采用线粒体靶向比率型 pericam（RPmt；激发波长 418 和 494 nm，发射波长 511 nm）测定。³³,³⁴ 小鼠新生心肌细胞以感染复数 50 感染编码 RPmt 的腺病毒 48 h。成年心肌细胞在接种 2 h 后进行 RPmt 腺病毒转导，实验于转导后第 2 天进行。RPmt 信号通过 FACSCanto II 流式细胞仪或 LSM800 共聚焦显微镜采集；流式数据采用 FlowJo v10 分析，共聚焦图像的激发比值使用 MetaMorph 软件计算。
同时采用 Rhod-2 探针（Ex/Em 552/581 nm）测定新生及成年心肌细胞中的线粒体 Ca²⁺。Rhod-2 以二甲基亚砜配制成 5 mmol/L 储备液，细胞在 37°C 下与 5 μmol/L Rhod-2 孵育 30 min，随后清洗去除未载入或非共价结合的探针。Rhod-2 信号通过流式细胞术或共聚焦显微镜采集，并使用 ZEN 与 FlowJo 软件分析。采用 MitoTracker Green FM 或 MitoTracker Deep Red FM 共染线粒体；在共聚焦图像中，仅将 MitoTracker 阳性区域纳入 Rhod-2 信号定量。
线粒体去极化测定
成年心肌细胞在 37°C 下负载 TMRM 探针 30 min，随后用 PBS 清洗。测定前以 Ru360（10 μmol/L）预处理 1 h，并在组胺（100 μmol/L）刺激后使用 LSM800 进行时间序列共聚焦成像。线粒体去极化时间定义为线粒体膜电位（ΔΨm）开始下降至达到最低值之间的时间。
线粒体通透性转换孔测定
采用既往报道的 calcein-Co²⁺ 技术测定心肌细胞中的线粒体通透性转换孔（MPTP）。³⁵ 细胞在 37°C 的常规培养基中负载 1 mmol/L calcein AM 30 min；需要淬灭胞质和细胞核 calcein 荧光时，在负载过程中加入 1 mmol/L CoCl₂。完成淬灭后清洗细胞，并以共聚焦显微镜监测 calcein 信号。必要时，在实验记录前 30 min 加入环孢素 A（CsA，1 μmol/L）或 Ru360（10 μmol/L）。
透射电子显微镜
不同基因型小鼠心脏先以 Ringer 溶液（pH 7.4）灌流去血，再以固定液〔4% 多聚甲醛、1% 戊二醛、0.1 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）及 4% 蔗糖〕灌流预固定。取左心室后，以含 0.8% 亚铁氰化钾和 2% 四氧化锇的 0.1 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液后固定 2 h。样本经梯度丙酮脱水，包埋于 Spurr 树脂，使用 Leica Ultracut R 切片机和玻璃刀切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，采用 Hitachi H-7600 透射电子显微镜观察。
培养的 H9c2 细胞在室温下以 0.1 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液中的 2.5% 戊二醛固定 1 h，使用细胞刮收集细胞团块，再以 1% 四氧化锇后固定 1 h，经乙醇脱水后包埋于 Epon 812 树脂。聚合后去除塑料，沿平行及垂直于培养瓶表面的方向切取超薄切片，以醋酸铀和硝酸铅复染后进行透射电镜观察。
内质网—线粒体接触按照既往方法量化。¹⁸ 使用 ImageJ 软件勾画线粒体和内质网膜，将选定区域转换为掩膜并计算内质网周长。两名研究者在盲法条件下独立完成图像定量；MAM 定量以与线粒体相连的内质网总长度除以内质网总周长表示。
氧耗率测定
采用 XFe96 细胞外通量分析仪（Seahorse Biosciences）测定氧耗率（OCR）。小鼠新生心肌细胞接种于 96 孔板（#102416-100），在正常培养基中接受 siRNA 或腺病毒处理 48 h。通过预实验确定测定时对照组最佳细胞密度约为 30000 个/孔。测定前 1 h 将细胞移出 CO₂ 培养箱，在 37°C 常规空气环境中孵育，并将培养基更换为 180 μL XF 测定培养基（#102365-100），其中含 10 mmol/L 葡萄糖、1 mmol/L 丙酮酸、2 mmol/L 谷氨酰胺，pH 7.4。将寡霉素、FCCP 及鱼藤酮/抗霉素 A 分别加入注射孔 A、B 和 C，终浓度依次为 1、4、0.5 和 0.5 μmol/L。通过连续注射 FCCP 直至 OCR 开始下降，确定最佳剂量。测定于 37°C 进行，每个循环包括混匀 3 min、等待 2 min、测量 3 min。使用 Wave 软件采集数据，并通过 XF Cell Mito Stress Test Generator 计算基础呼吸、最大呼吸、质子漏及偶联呼吸等指标。成年小鼠心脏分离线粒体的偶联测定按照已发表方案进行。³⁶
ROS 检测
线粒体 ROS 采用 MitoSOX Red（5 μmol/L；Ex/Em 510/580 nm）测定；线粒体膜电位采用罗丹明 123（Rh123，5 μmol/L；Ex/Em 488/535 nm）或 TMRM（100 nmol/L；Ex/Em 510/580 nm）测定。新生心肌细胞在 37°C 下分别与各探针孵育 30 min，随后清洗去除游离或未与膜结合的探针。必要时，测定前以 CsA（1 μmol/L）或 Ru360（10 μmol/L）预处理 1 h。细胞经 0.25% 胰蛋白酶消化后收集，使用 FACSCanto II 流式细胞仪检测，每份样本至少采集 10000 个事件，并采用 FlowJo v10 软件定量。
细胞凋亡检测
采用 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（#556547，BD Bioscience）检测小鼠新生心肌细胞凋亡。细胞接种于 6 孔板，培养 12 h 后给予正常糖〔NG，5.5 mmol/L〕或高糖〔HG，30 mmol/L〕处理 48 h。检测前以 CsA（1 μmol/L）或 Ru360（10 μmol/L）预处理 1 h。细胞清洗、胰酶消化并以培养基终止消化，随后按厂家说明制备并通过流式细胞术分析凋亡细胞比例。
组织学与免疫化学
使用 Picro-Sirius Red 染色试剂盒（#ab150681，Abcam）对左心室石蜡切片进行天狼星红染色；使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）对左心室冰冻切片进行 TUNEL 染色。
逆转录聚合酶链式反应
采用 RNeasy Mini Kit（#74106，QIAGEN）从心肌细胞或心脏中提取总 RNA，并使用 iScript cDNA Synthesis Kit（#170-8891，Bio-Rad）进行逆转录。实时定量 PCR 使用 iQ SYBR Green Supermix（#720001059，Bio-Rad）及 CFX96 系统完成。小鼠引物序列（5′–3′）如下：Fundc1，F：CCCCCTCCCCAAGACTATGA，R：CCACCCATTACAATCTGAGT；Itpr2，F：CCTCTACATTGGGGACATCGT，R：GGCACACCTTGAACAGGCA；Gapdh，F：CTACCCCACGGCAAGTTCA，R：CCAGTAGACTCCACGACAAC。
统计学分析
所有数据均以均值±标准差表示，除另有说明外，所有实验至少重复 3 次。两组数据采用 F 检验评价方差齐性，≥3 组采用 Brown-Forsythe 检验；正态性使用 Shapiro-Wilk 检验。两组比较在满足方差齐性和正态分布时采用标准 Student t 检验，否则采用 Mann-Whitney U 检验。
超过 2 组时，根据数据特征采用方差分析或相应的非参数检验。仅涉及 1 个因素时，满足假设者采用单因素方差分析并行 Bonferroni 事后检验，否则采用 Kruskal-Wallis 检验并行 Dunn 事后检验校正多重比较。涉及 2 个因素时，满足假设者采用双因素方差分析并行 Bonferroni 事后检验，否则采用 Scheirer-Ray-Hare 检验〔Kruskal-Wallis 检验的扩展形式〕并行 Dunn 事后检验。必要时对 P 值进行多重比较校正，P<0.05 视为差异有统计学意义。所有统计分析使用 SPSS 21 软件完成。
