一、引言
由于其本身结构和功能的复杂性，ADC生物分析存在挑战性。为了准确地表征ADC以及可能存在的各种分子种类，在药物开发的临床前及临床阶段都会用到一系列特定的生物分析方法，本文中将使用以下术语，这些术语同监管机构对行业所作的相关指南是一致的：
ADC：指的是通过化学连接剂连接了至少一种载荷的抗体或抗体片段。
ADC分析分为两种类型：偶联载荷分析（conjugated payload assay）和偶联抗体分析（conjugated antibody assay）。偶联载荷分析测定的是ADC上的载荷数量，偶联抗体分析测定的是带有载荷的抗体数量。
总抗体（Total antibody，tAb）：包括已经与载荷结合的或者尚未与载荷结合的抗体。
未结合载荷（游离载荷，Unconjugated payload (free payload)）：则是指未与抗体结合的小分子药物。
对于最新的白皮书来说，其成熟条件为液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）已经发展成了蛋白质治疗药物生物分析的重要分析平台，符合各个开发阶段要求的生物分析策略也被正式引入进来，相关的监管框架也相继建立起来。
该白皮书还对原立场文件中没有涉及到的可溶性靶点干扰、符合各个开发阶段要求的生物分析策略、针对DXd等现代细胞毒性药物的生命周期管理以及特定载荷稳定性考虑等进行了探讨。本文主要涉及的生物分析策略有总抗体、ADC、游离载荷定量分析，强调了药物与抗体比例（DAR）测定、免疫原性考虑、可溶性靶点影响的重要性。
二、ADC及其组成部分的测量
根据下图可以看出，技术平台的选择受试剂可获得性、连接子类型（可裂解型和不可裂解型）、通量、灵敏度等多方面因素的影响。配体结合测定法(LBA)中电化学发光免疫测定法(ECLIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)，有高通量、高灵敏度的特点，但是需要专门的捕获试剂和检测试剂。杂交免疫捕获LC-MS/MS（Hybrid immunocapture LC–MS/MS）对捕获试剂的要求低，选择性和特异性好，但是通量较低。LC-MS/MS被越来越广泛地应用到抗体药物偶联物的定量分析上。
针对ADC的生物分析方法应当考虑这些偶联物在体内会时间而改变其DAR值的情况，了解ADC的稳定性、清除机制和它引起免疫反应的能力，对选择合适的定量测定tAb和ADC的方法有非常重要的意义。
三、总抗体（tAb）的测定
tAb测定可测得所有循环DAR形式的ADC，完全解偶联的形式（DAR=0）也可以检测到。
图2：LBA对于tAb和ADC的检测格式
使用LC-MS/MS进行临床前定量tAb时，常用的方法有胰蛋白酶消化和替代肽的测定，根据所需特异性和所测ADC中分子实体的不同可以采用不同的关键试剂。ADC药物可以用蛋白A和蛋白G、抗人Ig抗体、靶抗原或者抗ID抗体来捕获，之后进行变性、还原处理，有时还需要进行烷基化处理。一般用胰蛋白酶或者其他序列特异性蛋白酶对蛋白质进行水解，得到可作为tAb替代分析物的特征性肽段。目前已鉴定出一些适用于多种临床前物种的通用胰蛋白酶肽段，如IgG的Fc区肽段VVSVLTVLHQDWLNGK、GPSVFPLAPSSK、TTPPVLDSDGSFFLYSK，来自可变区的肽段给定量分析赋予更大的特异性和可靠性。
理想情况下特征肽不应该出现切割遗漏或者翻译后修饰的问题，尽可能的选择两种肽，一个用于定量，另一个用以确认。大量的文献都已表明，使用稳定的通用内标物，即同位素标记肽或侧翼肽（在替代肽的两侧加上额外氨基酸的肽）可以提高分析的准确性、精确性。在临床前的工作流程中，使用Silumab这样的通用单克隆抗体已经被证明可以校正消化效率以及电离基质效应。为保证检测结果具有特异性，一般用LC-MS来测定总抗体，利用目标蛋白或者抗ID抗体对总抗体进行亲和富集；再对富集的样本做蛋白水解处理，从而释放出可用于定量的高特异性替代肽。
四、ADC的测定
测定ADC完整形式的PK的方法就是对DAR值至少为1的格式进行检测。检测方法的敏感性受所用检测方式和试剂的影响。其检测方法大致可分两种：偶联载荷检测方式或偶联抗体检测方式。
1）偶联载荷检测方式
该检测方法一般采用抗Fc抗体、抗独特型抗体或者靶点介导的捕获技术来富集所有的抗体类型，而基于载荷的检测则用来产生信号。在配体结合分析（LBA）中，通过对抗载荷的检测，会产生对DAR值敏感的结果，信号强度会随DAR值的增加而增大。但是DAR的敏感程度还受空间位阻、表位可及性、亲合力效应的影响。而在杂交LC-MS/MS法中，DAR敏感的测定一般是先捕获抗体，再用酶促或者化学方法释放载荷，最后将定量结果作为共轭抗体的替代指标。
2）偶联抗体检测方式
这种测定法一般以抗载荷抗体为捕获试剂，用抗Fc或者抗独特型抗体配体结合法进行检测。该方法是否适用要根据研究设计来决定。需要注意的就是，这种测定方法对于DAR是不敏感的，所测得的浓度不能反映体内研究阶段发生的DAR的变化，这主要由于捕获抗体不能按与ADC结合的载荷分子数量来进行区分所致。
由于LC-MS/MS法其具有更高的特异性和DAR敏感性，且不需要使用抗载荷试剂，因此业界越来越多地采用LC-MS/MS法来对ADC进行定量分析。另外基于LC-MS/MS的联合检测方法可以同时测定ADC和总抗体，从而提高检测效率。需要注意的是，虽然缩短了开发方法周期，但是也增加了分析的复杂性。在该流程下，可以将ADC捕获后，分样处理：一部分用于总抗体的测定，另一部分酶裂解或者化学法释放载荷来测定。
已报道的方法有木瓜蛋白酶消化法、组织蛋白酶B裂解法、化学法释放 payload作为 ADC的替代分析物。另一种二合一的方式就是先特意释放出 payload，再使用特异性酶（胰蛋白酶等）消化，产生代表总抗体的肽段。
LBA以及LC-MS/MS都适用于ADC分析的测定方法，使用检测试剂或者捕获试剂时会出现DAR相关的定量偏差，这就突出了在方法开发过程中评价不同DAR分布上测定性能的重要性。一般可以选用已知DAR值的标准品或参考物质来考察DAR对精密度、准确度和可解释性的影响。
五、游离载荷的测定
具有稳定连接子的ADC将极少量的游离载荷释放到全身循环中，所以游离载荷浓度一般很低。相关指导原则提出在首次人体试验时要测定游离载荷的全身暴露量，是否在之后的阶段把该指标排除在外，应该考虑安全性数据（例如关于ADC作用机制的临床前数据）。如果采用灵敏度足够高的检测方法也不能检测出游离载荷的话，则后续检测游离载荷可能就没有必要了。
由于具有很高的灵敏度和特异性，LC–MS/MS已经成为定量测定小分子游离载荷的首要析方法。通常从血浆等样品中分离出游离载荷，常用的样品制备方法有蛋白质沉淀（PP）、液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）等。需要注意的是，操作的时候一定不能使偶联载荷意外地从抗体上脱落下来，否则会使得定量的结果产生偏差。
游离载荷的生物分析还存在着独特的困难：ADC标准品中通常含有亚ng/mL至低ng/mL浓度范围内的载荷分子及其相关杂质，从而给评价ADC对载荷定量结果的影响带来了更大的困难。对于如何减小ADC中的杂质以及降解物的影响的具体策略，在后续稳定性考量处进行说明。
六、DAR分布的测定
目前，监管机构并不强制要求在生物分析方法中提供DAR值数据。但是，测量DAR值对于决策以及问题解决的分析是很有价值的。DAR分析可以看作是基于风险的一种评估工具（尤其是跨物种转化的问题），在早期风险排查（怀疑存在不稳定的连接剂或者快速解偶联现象）、解释安全性信号、证明可比性方面都很有价值。
由于ADC的DAR分布是关键特性，所以建议在临床前、临床研究样本分析中对其进行监测。建议在ADC开发早期跟踪平均DAR值，评估连接子稳定性以及DAR特性。如下图所示，将ADC数据同总抗体（tAb）测定结果结合起来就可求得平均DAR值。
DAR分布测量的方法：计算平均DAR
通过临床前物种上给药后随时间变化的平均DAR值可以反映出连接子的稳定性，在药物研发阶段可以候选药物进行排序。在药物开发过程中，DAR趋势图是评价ADC连接子的稳定性的有效工具。图表可以用来跟踪临床前及临床研究时给药之后平均DAR的变化。早期临床研究（如第一次人体试验）充分表征DAR特性之后，了解了连接子的稳定性，在某些情况下可以不再继续对DAR分析。这些情况包括全身暴露量少、总抗体浓度与ADC浓度呈高度相关性。
虽然平均DAR值是被广泛接受的策略，但是在某些情况下，测定单个DAR物种能够更加细致地表现出ADC的异质性（下图）。
DAR分布测量的方法： 使用高分辨率质谱法测量单个DAR
完整的蛋白和middle-down的高分辨质谱法(HRMS)可以对具体的DAR值成分进行定量分析，如DAR0、DAR2、DAR4等。通过“混合分析”的HRMS方法就可以实现各个DAR物种的定量检测，近几年来native MS、SEC-native MS、nRPLC-MS以及HIC-MS也被用于完整蛋白的DAR测定。
未完待续……
