1.文章信息
2.文章简介
迄今为止，在去除海水养殖废水中的硝酸盐(NO3--N)方面，缺乏对元素硫驱动的自养反硝化 (SDAD) 工艺进行系统研究。为此，我们建立了连续运行230天的填料床反应器，来研究SDAD生物膜工艺的运行性能、动力学特性和微生物群落。结果表明，NO3- -
N去除率和去除速率随HRT (1-4
h)、进水NO3- -
N 浓度 (25-100 mg·L-1)和DO浓度 (0.2 - 7.0 mg·L-1)以及温度 (10 ℃ - 30 ℃) 的不同而变化，分别在51.4%
- 98.6% 和0.054 - 0.546 g · L-1·d-1范围内。石灰石可以中和部分反应中产生的酸性。小部分NO3- -
N在反应器中转化为亚硝酸盐（< 4.5%）和氨（<
2.8%）。操作条件也会影响酸性，影响亚硝酸盐、氨和硫酸盐的生成量。缩短HRT和增加进水NO3-- N 浓度，可使反应器NO3- -
N去除率的最优拟合模型从半阶变为零阶。此外，较高的温度，较高的进水NO3- -
N 浓度，较低的HRT以及较低的进水DO浓度也会加速NO3-- N 的去除。在自养反硝化菌富集培养和反应器启动运行过程中，微生物丰富度、均匀度和多样性逐渐降低。其中Sulfurimonas是反应器中的优势菌属和主要功能菌。本研究表明SDAD是控制海水养殖废水排放引起的沿海富营养化的一种有前景的方法。
3.实验设计
4.图文导读
经较短适应期（即在进料批处理模式下操作）后循环运行逐渐提高了SDAD反应器去除NO3- -
N和TN的性能。当反应器以连续流动模式运行时，缩短HRT可立即降低NO3- -
N和TN的去除效率，但其会随着后续的操作而逐渐增加。在启动阶段结束时，NO3-- N和TN的去除效率保持相对稳定，表明反应堆启动成功。 图2显示了整个运行期间污水中NO3- -
N、NO2-- N、NH3 -- N和SO42- 浓度和pH值的变化。相比进水通过SDAD生物膜反应器时，出水的NO3− - N浓度显著下降，而SO42-浓度大幅增加，说明SDAD工艺可以有效地降低海水养殖废水中的NO3- - N，同时将元素硫氧化为SO42-。在生物膜反应器中，将一小部分NO3- - N转化为NO2- - N(NAR < 4.5%) ，可归因于部分反硝化作用 (PD)。完整的SDAD可看作是由两步组成的连续反应过程，即将NO3- - N还原为NO2- -
N和NO2- - N还原为N2。一些研究人员观察到了SDAD过程中NO2- - N的积累，这可以通过控制操作条件使SDAD保持在PD步骤来实现。在出水中也有少量的NH3 - N积累 (AAR < 2.8%) ，这可能是由于SDAD生物膜反应器中硝酸盐异化还原为氨 (DNRA) 作用。然而，在生物膜反应器中，完整的SDAD主导了NO3- - N的去除。 出水pH值 (7.03–8.05) 普遍低于进水 (7.80–8.15)。因此，海水养殖废水中的SDAD反应是一个碱度消耗过程。石灰石由于碱度释放缓慢，不能完全中和SDAD反应产生的酸性。SDAD的更高效和更经济的缓冲过程值得进一步研究。此外，结合部分硝化作用也可以降低SDAD产生的酸度。
此外，HRT、温度和DO和进水NO3-- N浓度对NO3- - N的去除和SO42-、酸度、NO2- - N和NH3 - N的生成有不同的影响。当操作参数改变时，SDAD生物膜反应器失稳2-5天后在每个阶段都达到了一个新的稳态。以下，基于稳态运行数据，分析了SDAD性能和NH3 - N去除动力学的影响因素。(2) SDAD性能的影响因素
图3a和b显示了NRE、NRR、NAR和AAR随HRT和进水NO3- - N浓度的变化。随着HRT从1h延长到4h，NRE从76.3% ± 0.7% 增加到94.8% ± 1.2%，NRR从0.359 ± 0.008下降到0.112 ± 0.003 g L-1 d-1。HRT较长。SDAD反应时间更多，从而增加了NRE，而它降低了反应器的水处理能力，从而降低了NRR。相反，当进水NO3- - N浓度从25 mg · L-1增加到100 mg · L-1时，NRE从94.9% ± 0.8%下降到68.4% ± 1.0%，而NRR从0.109 ± 0.008增长到0.333±0.007 g · L-1 d-1。
SDAD生物膜反应器的NVL主要由HRT和进水NO3-- N浓度决定，这可以反映它们对运行性能的综合影响。如图4所示，NVL的增加导致了NRE的下降，而NRR的增加。当NVL超过1.0 g · L-1 d-1时，NRR几乎保持不变。 随着HRT的延长，NAR明显从1.6% ± 0.3%下降到0.5% ± 0.3%，AAR从1.3% ± 0.2% 略有上升到1.9% ± 0.2% (图3a)。NO3- - N浓度的增加对NAR的影响不大，但对AAR的影响略有升高（图3b）。因此，较长时间的HRT可以促进完整的SDAD过程，并可以通过缩短HRT和降低流入的NO3- -
N浓度来抑制DNRA过程。 图3c显示，随着温度从10℃上升到20℃，NRE从39.7% ± 1.1% 迅速上升到85.9% ± 1.3%；随着温度进一步升高到30℃，NRE缓慢上升。NRR表现出与NRE相似的增长趋势，从10℃时的0.093±0.003 g · L-1 d-1到30℃时的0.226±0.007 g · L-1 d-1 。在10℃ - 20℃的温度范围内，NAR从3.4% ± 0.6%迅速下降到0.9% ± 0.2% ，然后在30℃时缓慢下降到0.2% ± 0.3%；但AAR保持在一个相对稳定的水平。因此，SDAD生物膜反应器中的温度应尽可能控制在20℃以上。YS值在10℃ - 30℃范围内逐渐增加,在25℃以上的温度下接近理论值（表2）。随着ΔCNO3随温度的升高，平均ΔpH从0.35上升到0.80（图2）。大多数嗜中温硫氧化细菌的最佳温度为25℃ -
35℃。 低温会显著降低脱氮效率。对于与养殖装置一起布置的水净化装置，室内温度控制器可以确保SDAD工艺的温度。对于室外水处理单元，增加HRT可以部分抵消冬季低温引起的脱氮性能的降低。③流体DO浓度
如图3d所示，随进水DO浓度的增加，NRE和NRR分别从85.5% ± 0.8%和0.201 ± 0.20.010 g · L-1 d-1到80.5 % ± 0.6 % 和0.193 ± 0.0.07 g · L-1 d-1。因此，进水DO浓度（0.2 - 7.0 mg · L-1）对SDAD反应器脱氮能力的影响几乎可以忽略不计。将进水DO浓度从0.2 - 0.5mg · L-1上调至2.0 - 4.0mg · L-1时，NAR和AAR略有下降，而进一步上调至5.0 - 7.0mg · L-1时，NAR和AAR略有升高。
表2显示，随着进水DO浓度的上调，YS值显著增加。有氧条件下的YS值均高于理论值。随着进水DO浓度的增加，ΔCNO3几乎保持稳定，但平均ΔpH从0.58显著增加到0.71。许多无机化能营养的硫氧化细菌可以利用O2作为电子受体，从而增加SDAD反应器中SO42-的产量和酸度。因此，建议将进水DO浓度保持在2.0mg · L-1以下，以降低SDAD反应器中的SO42-和酸度的产生。（3）SDAD生物膜反应器中的硝酸盐去除动力学
图5显示了不同操作条件下NO3- - N、NO2- - N、NH3 - N和SO42-浓度沿填料层高度的分布。当海水养殖废水沿填充层自下而上流动时，NO3-- N和SO42-浓度分别呈递减和递增趋势，NH3 - N浓度除在某些操作条件下，在填充层60-100 cm处略有下降外，其余均呈上升趋势。作为反硝化过程中重要的中间产物，NO2- - N的浓度在生物膜反应器中呈先升高后逐渐降低的趋势，且随着进水NO3- - N和DO浓度的升高以及HRT和温度的降低，峰值位置有向出口移动的趋势。 采用零阶、半阶和一阶动力学模型拟合NO3- - N浓度与填料层高度的关系。根据拟合优度确定最优拟合模型，拟合优度用决定系数R2表示。不同运行情况下的速率常数和R2值如表2所示。结果表明，半阶动力学模型在第一阶段 (HRT = 4 h) 和第二阶段 (HRT = 3 h) 进水NO3- - N浓度为25 ~ 75 mg · L-1、第三阶段 ( HRT = 2 h ) 进水NO3- - N浓度为25 ~ 50 mg · L-1、第四阶段 ( HRT = 1 h ) 进水NO3- - N浓度为25 mg · L-1时拟合最佳，而在第1 - 4阶段其他条件下，零阶动力学模型拟合最佳。因此，缩短HRT和增加进水NO3- - N浓度可以将最优拟合模型从半阶变为零阶。半阶动力学模型在第V期各温度 ( 100℃~ 30℃ ) 和第VI期各进水DO浓度 ( 0.2 ~ 7.0 mg · L-1 ) 下R2值均最大，说明温度和进水DO浓度的变化不会改变最优拟合模型。 此外，速率常数的变化表明，提高进水NO3-- N浓度和温度，降低HRT和进水DO浓度，可以加速SDAD反应器对NO3--
N的去除。最优拟合模型的顺序由反硝化反应顺序和β决定。同样，速率常数(k0和k0.5)取决于生物膜内NO3−- N扩散系数和反硝化速率常数以及生物膜的厚度和比表面积，这与操作条件密切相关。（4）SDAD生物膜反应器中的微生物群落
①不同样品间微生物群落多样性的演替
所有样本通过16S rRNA基因测序共获得143046条有效序列。如图 6a所示，有效序列样本，接种污泥，驯化污泥，SDAD反应器的底部，中间和顶部分别聚集为966、358、333、365和350 个OTU，共享165 个OTU。接种污泥样品中独有的OTU数量为465个，远高于其他样品。此外，在硫基自养反硝化菌富集培养过程中，筛选出接种污泥中67.08% 的OTU；启动和连续运行后，SDAD生物膜反应器底、中、顶层生物膜分别保留65.36%、67.60%、66.20%的含量。 在OTU水平上使用PCoA对5个样品的微生物群落进行比较 (图6b ) 。结果表明，前两个主坐标（即PCo1和PCo2）可以解释5个样品之间97.06%的变异，贡献比分别为77.83%（PCo1）和19.23%（PCo2）。根据样品之间的距离，可将样品分为三组（即接种污泥、驯化污泥和反应器生物膜），各组间的微生物群落存在显著差异。因此，通过硫基自养反硝化菌的富集培养和SDAD反应器的启动和连续运行，可以重塑微生物群落。然而，来自反应器底部、中间和顶部的生物膜样品之间的紧密聚类表明，SDAD反应器中的微生物群落具有很强的相似性。
如表3所示，所有六个指标遵循降序：接种污泥>驯化污泥>反应器生物膜，这表明在自养反硝化菌富集培养和反应器的启动和运行期间，微生物丰富度、均匀度和多样性逐渐减少。此外，微生物在生物膜反应器中的分布并不均匀。生物膜的丰富度指数在反应器中部最高，其次是顶部和底部，而生物膜的均匀度和生物多样性指数从下到上逐步增加。 图6c描述了这些样品在门水平上微生物群落组成的具体差异。可以看出，种子污泥中的微生物由细菌和古菌组成，相对丰度分别为91.47%和8.53%，而在S驯化污泥 (< 0.01%) 和反应器生物膜 (< 0.05%) 中，古菌几乎消失。接种污泥中优势菌门为 Proteobacteria，相对丰度为54.02%，其次为Bacteroidetes (8.61%) 、Actinobacteria (5.69%) 、Nitrospirae (4.96%) 、Gemmatimonadetes (3.22%) 、Caldithrix (2.13%) 、Acidobacteria (1.39%)和 Chloroflexi (1.00%), 以及其余21个低丰度门 (总相对丰度为2.91%) 。未分类门占播种污泥微生物群落的7.56%。经过3个月的富集培养，S驯化污泥中的微生物群落基本被Proteobacteria (96.57%) 、 Bacteroidetes (2.54%) 和Actinobacteria (0.51%) 所占据，其他门的相对丰度均小于0.1%。反应器生物膜具有与S驯化污泥相似的细菌门类。Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria也是反应器生物膜中的优势菌群，分别占92.39% ~ 95.04%、4.26% ~ 6.61%和0.28% ~ 0.46%。
为了阐明SDAD生物膜反应器中去除NO3- - N的功能细菌，我们在纲水平（图7a）和属水平（图7b）上进一步分析了驯化污泥和反应器生物膜的微生物群落结构。 结果表明，随着微生物分类等级的降低，S驯化污泥和反应器生物膜的微生物群落组成差异逐渐明显。在S驯化污泥和SDAD生物膜反应器的底部、中部和顶部的样品中，分别鉴定出42、37、42和41个纲。然而，在这些样品中，变形菌门只有3个纲 (即Epsilonproteobacteria、Gammaproteobacteria和Alphaproteobactiera)，拟杆菌门只有1个纲 (即Flavobacteriia) 的相对丰度在1%以上。 以往研究报道，大多数硫氧化自养反硝化菌分布在Alphaproteobactiera、Betaproteobactiera、Gammaproteobacteria和Epsilonproteobacter 等4类变形菌中。在S驯化污泥和反应器生物膜样品中，Betaproteobacteria对微生物群落的贡献不到0.1%。S驯化污泥中Epsilonproteobacteria、Gammaproteobacteria和Alphaproteobactier的相对丰度分别为85.54%、7.57%和3.07%，与反应器底部生物膜中的相对丰度接近。沿着SDAD反应器从下向上，生物膜中Epsilonproteobacteria的相对丰度从83.64%下降到64.17%，而Gammaproteobacteria和Alphaproteobactier的相对丰度分别从7.89%和3.16%上升到23.11%和5.74%。 如图7b所示，Sulfurimonas在S驯化污泥和反应器底部、中间和顶部分别检测到的47、46、51和48个属中相对丰度最高，也是在这些样品中检测到的唯一的Epsilonproteobacteria属。Sulfurimonas在化学上不同的环境 (如深海热液喷口、海洋沉积物、海水柱、河口、土壤和废水处理系统) 中无处不在，并且可以在各种电子供体、电子受体和碳源上生存。许多Sulfurimonas (如S. denitrificans、S. gotlandica)可以利用无机碳源(如二氧化碳和碳酸氢盐)，将无机还原性硫化合物 (如硫化物、单质硫和硫代硫酸盐) 和氢气的氧化与氮氧化物(如硝酸盐和亚硝酸盐) 的还原联系起来。 这些物种基因组中的功能基因可以编码硫代谢 (如硫化物:醌还原酶、硫氧化蛋白和ATP硫酰化酶)、氢代谢 (如氢化酶) 和NO3−-
N完全还原为N2 (如硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶) 所需的关键酶。值得注意的是，氧也可以作为Sulfurimonas的电子供体，因为其基因组中ccoNOQP操纵子编码的cbb3型细胞色素c氧化酶可以参与将电子从细胞色素c转移到氧并将氧还原为水。因此，进水DO对Sulfurimonas的生物活性几乎没有抑制作用，但可能会与氮氧化物竞争电子供体。 虽然Sulfurimonas通常被认为是化学化能自养生物，但它们也可以使用一些有机化合物来支持自己的生长，例如，S. denitrificans可以消耗甲酸盐、富马酸盐、酵母提取物和酒精混合物作为电子供体。因此，硫单胞菌的多种代谢策略可以解释它们在各种环境中的成功定殖。Sulfurimonas的相对丰度在接种污泥中为0.6%，在S驯化污泥中增加了近143倍。除了充足的还原性硫，NO3-- N以及适宜的环境条件外，在富集培养过程中，添加磷也可能刺激Sulfurimonas的繁殖。 Thiomicrospira中的某些物种(例如sp. CVO)可以通过还原的硫化合物作为电子供体来驱动反硝化过程。Thiomicrospira的相对丰度从播种污泥的0.15% 上升到S驯化污泥的3.58%，再下降到反应器中的0.50%-1.70%。因此，在自养反硝化菌的富集培养和反应器运行过程中，Thiomicrospira无法主导微生物群落，可能是由于Sulfurimonas对底物的激烈竞争。 Methylophaga被称为嗜卤碱性限制性兼性嗜甲基菌，已在处理含盐废水的甲醇反硝化系统中被发现。据报道，在以甲醇作为额外碳源的两种海洋生物膜反应器 (即固定床反应器和流化床反应器) 中，Methylophaga可能是主要的细菌类群。而在SDAD生物膜反应器中，由于有机碳源缺乏，Methylophaga在微生物群落中占少数 (0.84% ~ 1.56%)。尽管如此，与S驯化污泥，生物膜中Methylophaga的相对丰度仍然增加 (0.34%)，这可能是因为自养菌的代谢和微生物细胞的分解可以为Methylophaga提供少量的有机物。S驯化污泥中Aequorivita的相对丰度小于0.1%，而生物膜反应器中Aequorivita的相对丰度可达1.34% ~ 3.07%。Aequorivita被鉴定为严格好氧化异养细菌，不能还原NO3-- N。反硝化菌富集培养所需的厌氧环境会抑制Aequorivita的生长和繁殖。然而，在第六阶段的最后20天，高的进水DO浓度可能为Aequorivita的增殖创造有利的环境。其余属在生物膜反应器中的相对丰度均小于1.00%。5.主要结论
SDAD工艺可以去除海水养殖废水中的NO3-- N，同时产生SO42-和酸性。SDAD工艺还产生少量NO2-- N (NAR < 4.5%) 和NH3 - N (AAR < 2.8%)。HRT (1 - 4 h) 、进水NO3-- N浓度 (25-100 mg · L-1) 和DO浓度 (0.2 - 7.0 mg · L-1) 、温度 (100℃- 30℃) 等操作条件会影响NO3-- N的去除效率和速率、SO42-的生成和酸度，以及NO2-- N和NH3 - N的积累。石灰石可以部分中和SDAD反应器中产生的酸性。NO3-- N浓度沿SDAD反应器的分布可以用零阶或半阶动力学模型来描述。缩短HRT和增加进水NO3-- N浓度可以使最优拟合模型从半阶变为零阶。此外，通过提高进水NO3-- N浓度和温度，降低HRT和进水DO浓度，可以加速SDAD反应器中NO3--
N的去除。从接种污泥到S驯化污泥再到反应器生物膜，微生物的丰富度、均匀度和多样性逐渐降低。Sulfurimonas的相对丰度沿SDAD反应器自下而上从83.64%下降到64.17%，是生物膜中的优势菌属，也是SDAD工艺的主要功能菌。Thiomicrospira是另一种硫氧化菌，占生物膜反应器微生物群落的0.50% ~ 1.70%。文章链接:https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2023.139354排版：张逸凡
审核：赵林
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