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溶瘤病毒
溶瘤病毒疗法（Oncolytic Virus, OV）是基于病毒在肿瘤中的感染和复制来杀死肿瘤细胞的免疫疗法，其在复制高效性、肿瘤靶向性佳、肿瘤杀伤途径多、不良反应小等多方面仍具有明显优势。
图1：溶瘤病毒的作用机制（来源:网络）
直接溶瘤作用：溶瘤病毒可以在肿瘤细胞中选择性复制，裂解肿瘤细胞并释放出子代病毒感染邻近细胞，诱导肿瘤细胞死亡。OV的选择性来自以下几个方面：首先，溶瘤病毒能与肿瘤细胞高表达的某些特定受体选择性结合并感染细胞。同时，肿瘤细胞中干扰素（IFN）P53RAS/RAF/MEK/ERK 等通路异常，病毒更易在其中存活和复制，最后，肿瘤细胞IFN/PKR通路异常，阻碍了病毒清除过程，有利于病毒在其中复制。
激活抗瘤免疫：溶瘤病毒可通过多种机制激活抗肿瘤免疫，包括固有免疫和适应性免疫。病毒裂解细胞后释放出病原相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP），并由模式识别受体（PRR）感知，刺激多种炎性细胞因子和趋化因子分泌，促进固有免疫系统活化。OV感染过程中抗肿瘤适应性免疫主要由肿瘤特异性T细胞介导，肿瘤细胞裂解后，肿瘤相关抗原和新抗原释放，由抗原呈递细胞呈递给肿瘤特异性T细胞，激活T细胞杀伤肿瘤细胞。
破坏肿瘤血管系统：腺病毒、痘苗病毒、麻疹病毒等OV可以感染并杀伤肿瘤微环境中的内皮和基质细胞，这两种细胞在肿瘤发展和转移中发挥重要作用。此外，经过基因修饰的OV也可以表达相关因子以抑制肿瘤新生血管生成。
溶瘤病毒药物载体的种类
溶瘤病毒载体可分为 DNA 病毒载体和 RNA 病毒载体。其中，DNA 病毒主要以 HSV、AdV、VV 和细小病毒 H1（parvovirus H1）为主；RNA 病毒主要以RV、柯萨奇病毒（coxsackie virus，CV）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus，PV）、麻疹病毒（measles virus，MV）、NDV 及水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）为主。
溶瘤病毒——HSV 下游纯化工艺解决方案
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是一种有包膜的嗜神经性双链DNA 病毒， 有 HSV-1 和 HSV-2 这 2 种血清型，是研究最广泛的 DNA 病毒之一。HSV 有很大的基因组（约 150 kb），其中部分基因对病毒复制不是必需的，这为在不限制病毒的包装效率的前提下插入外源功能性基因提供了足够的空间，使其成为 OV 治疗领域的应用最广泛的溶瘤病毒药物载体。
HSV制备工艺
HSV多选用Vero细胞应用微载体在生物反应器中大规模培养制备细胞，胰酶消化收集细胞，细胞反复冻融裂解，裂解后加入核酸酶（BenzoNuclease）剪切HC-DNA,HC-RNA降低粘度，之后离心去除细胞碎片等固形物，在经MF等进行澄清处理，澄清可采用UF/DF+Seplife 4FF的纯化模式，也可采用阴离子交换Q Large Scale捕获及初步纯化，在用多模式层析填料Seplife Suncore 700流穿模式进行精细纯化，纯化后UF/DF置换缓冲液并调整浓度，后经除菌过滤并制剂化制备而成。
1.细胞培养：Vero细胞是贴壁依赖型细胞，在反应器中大规模培养Vero要用微载体（Seplife LX-MC-dex1）培养。
Vero细胞在两家不同批次微载体的培养基中，24h至96h细胞生长曲线如图1所示。
图1：蓝晓科技细胞培养微载体和进口微载体用于Vero细胞培养生长曲线
细胞生长情况观察
图2：蓝晓科技细胞培养微载体用于Vore细胞培养细胞生长情况观察
2.胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，细胞裂解，固液分离，澄清，浓缩：略
3.层析纯化：澄清的病毒溶液先用阴离子交换层析填料Q Large Scale或Seplife LXPM Q400进行初步纯化并减少体积富集病毒，去除大量的HCP及HC-DNA，HC-RNA等杂质，初步纯化后在用多模式层析Seplife Suncore 700填料进行流穿模式纯化。
壳层技术多模式层析介质，是蓝晓科技自主研发的一种新型多模式琼脂糖层析介质，用于病毒等生物大分子的中度纯化和精细纯化。该层析介质运用新型壳层微球技术及辛胺配基，具有凝胶过滤和吸附分离双重功能。核心功能区键合强吸附配体辛胺，以静电力及疏水作用力在宽泛的pH和离子强度下结合分子，同时核心功能区外层有约5um的壳层，壳层上有700 KDa / 400 KDa的空隙和核心功能区连通。新型壳层微球技术可有效捕获污染物，同时使目标分子流穿。Seplife Suncore 700 / 400层析介质具有高流速、低反压、高处理量、良好的化学稳定性和机械性等特点，方便进行规模放大，可缩短生产时间，提高生产效率。澄清的溶液流经柱床时，大于700 KDa / 400 KDa的生物分子被排阻在壳层外面，通过外水体积流穿，而小于700 KDa / 400 KDa的生物分子通过壳层的空隙进入核心功能区，并结合在核心中，从而在较高流速及较大上样量的状态，依然能超大生物分子和其它生物分子的分离。
图3：壳层技术多模式层析介质结构示意图（蓝晓科技）
扫码免费申请试用装4.除菌过滤，制剂化：略。
参考资料
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2.Cao G D, He X B, Sun Q, et al. The oncolytic virus in cancer diagnosis and treatment[J]. Front Oncol, 2020, 10: 01786. DOI: 10.3389/fonc.2020.01786.
3.Desjardins A, Gromeier M, Herndon JE 2nd, et al. Recurrent glioblastoma treated with recombinant poliovirus. N Engl J Med 2018;379:150-61.
4. Friedman GK, Johnston JM, Bag AK, et al. Oncolytic HSV-1 G207 immunovirotherapy for pediatric high-grade gliomas. N Engl J Med 2021;384:1613-22.
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