确定两个基因上下游关系，核心是通过实验验证基因A的表达产物是否调控基因B的表达，或两者在代谢/信号通路中存在明确的先后作用顺序。以下是关键分析流程：
1. 初步预测（生物信息学分析）
✓通路数据库匹配：在KEGG、Reactome等数据库中，输入两个基因名称，查看是否同属某一信号通路（如MAPK通路）或代谢途径，数据库标注的通路上下游顺序可作为初步依据。
✓转录因子结合预测：用JASPAR、TFbind等工具，分析上游候选基因是否为转录因子，及其是否存在结合下游候选基因启动子区域的结合位点。
2. 实验验证（核心步骤）
（1）表达调控关系验证（最直接证据）
1. 干预上游候选基因：通过基因敲降（siRNA/shRNA）、敲除（CRISPR-Cas9）或过表达（质粒/病毒载体），改变其在细胞/个体中的表达水平。
2. 检测下游候选基因：用RT-qPCR测mRNA水平、Western blot测蛋白水平，观察前者表达变化是否导致后者表达显著上调/下调。若A表达↑→B表达↑，或A表达↓→B表达↓，则A可能为B的上游基因。
（2）直接作用验证（排除间接调控）
✓染色质免疫共沉淀（ChIP）：若A是转录因子，用A的特异性抗体沉淀DNA-蛋白复合物，通过PCR检测是否结合B的启动子区域，验证直接调控。
✓免疫共沉淀（CoIP）：若A、B为蛋白，用A的抗体沉淀蛋白复合物，检测是否含B，验证两者直接相互作用（适用于非转录调控的上下游关系）。
3. 结果交叉验证
在不同细胞系/组织中重复上述实验，或通过动物模型（如基因敲除小鼠）观察体内基因表达变化，排除细胞特异性干扰，确认上下游关系的稳定性。
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1. 初步预测（生物信息学分析）
✓通路数据库匹配：在KEGG、Reactome等数据库中，输入两个基因名称，查看是否同属某一信号通路（如MAPK通路）或代谢途径，数据库标注的通路上下游顺序可作为初步依据。
✓转录因子结合预测：用JASPAR、TFbind等工具，分析上游候选基因是否为转录因子，及其是否存在结合下游候选基因启动子区域的结合位点。
2. 实验验证（核心步骤）
（1）表达调控关系验证（最直接证据）
1. 干预上游候选基因：通过基因敲降（siRNA/shRNA）、敲除（CRISPR-Cas9）或过表达（质粒/病毒载体），改变其在细胞/个体中的表达水平。
2. 检测下游候选基因：用RT-qPCR测mRNA水平、Western blot测蛋白水平，观察前者表达变化是否导致后者表达显著上调/下调。若A表达↑→B表达↑，或A表达↓→B表达↓，则A可能为B的上游基因。
（2）直接作用验证（排除间接调控）
✓染色质免疫共沉淀（ChIP）：若A是转录因子，用A的特异性抗体沉淀DNA-蛋白复合物，通过PCR检测是否结合B的启动子区域，验证直接调控。
✓免疫共沉淀（CoIP）：若A、B为蛋白，用A的抗体沉淀蛋白复合物，检测是否含B，验证两者直接相互作用（适用于非转录调控的上下游关系）。
3. 结果交叉验证
在不同细胞系/组织中重复上述实验，或通过动物模型（如基因敲除小鼠）观察体内基因表达变化，排除细胞特异性干扰，确认上下游关系的稳定性。
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