样本前处理
细胞清洗
吸弃培养基，使用PBS轻柔漂洗3次，每次5分钟。细胞固定
采用4%多聚甲醛（PFA）室温固定15分钟，PBS漂洗3次。建议改用预冷至–20°C的冰甲醇固定10分钟，可显著提高抗原保留效果与信噪比。
通透与封闭
细胞膜通透
使用0.1% Triton X-100室温通透15分钟，PBS漂洗3次。
非特异性位点封闭
使用10% BSA室温封闭1小时，PBS漂洗3次。
抗体孵育
一抗孵育
按1:300比例使用抗体稀释液稀释一抗，4°C孵育过夜。
结束后使用PBS漂洗3次。
二抗孵育
按1:1000比例使用抗体稀释液稀释二抗，室温避光孵育1小时。
PBS漂洗3次。
核染色与镜检
细胞核染色
使用Hoechst 33342室温避光染色6分钟，PBS漂洗3次。
封片与成像
每皿加入300 µL PBS，使用共聚焦显微镜进行图像采集。
实验注意事项
抗体稀释：建议使用商品化抗体稀释液，具体稀释比例请参考各抗体说明书。
细胞状态：细胞状态对染色质量至关重要。若细胞存在轻度污染或背景不干净，将显著影响成像质量。
方法差异：不同实验室在染色条件上可能存在差异，本方案仅供参考，请根据实际体系优化。
细胞清洗
吸弃培养基，使用PBS轻柔漂洗3次，每次5分钟。细胞固定
采用4%多聚甲醛（PFA）室温固定15分钟，PBS漂洗3次。建议改用预冷至–20°C的冰甲醇固定10分钟，可显著提高抗原保留效果与信噪比。
通透与封闭
细胞膜通透
使用0.1% Triton X-100室温通透15分钟，PBS漂洗3次。
非特异性位点封闭
使用10% BSA室温封闭1小时，PBS漂洗3次。
抗体孵育
一抗孵育
按1:300比例使用抗体稀释液稀释一抗，4°C孵育过夜。
结束后使用PBS漂洗3次。
二抗孵育
按1:1000比例使用抗体稀释液稀释二抗，室温避光孵育1小时。
PBS漂洗3次。
核染色与镜检
细胞核染色
使用Hoechst 33342室温避光染色6分钟，PBS漂洗3次。
封片与成像
每皿加入300 µL PBS，使用共聚焦显微镜进行图像采集。
实验注意事项
抗体稀释：建议使用商品化抗体稀释液，具体稀释比例请参考各抗体说明书。
细胞状态：细胞状态对染色质量至关重要。若细胞存在轻度污染或背景不干净，将显著影响成像质量。
方法差异：不同实验室在染色条件上可能存在差异，本方案仅供参考，请根据实际体系优化。
