?一、实验原理
简单来说，就是用荧光标记抗体去“钓”目标蛋白，通过荧光显微镜观察蛋白的位置和表达。
• 直接法：一抗直接带荧光，步骤少但成本高。
• 间接法：二抗带荧光，信号更强，灵敏度更高。
关键工具：荧光显微镜、特异性抗体、固定和透化处理。
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?二、主要用途
1️⃣蛋白定位：看蛋白在细胞的哪个位置（膜上、核里）。
2️⃣共定位研究：两种蛋白是否“住”在一起（比如线粒体和凋亡蛋白）。
3️⃣疾病诊断：检测病毒抗原（HPV）或自身免疫病抗体。
4️⃣药物研究：看药物对蛋白的影响。
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?三、溶液配制
|4%多聚甲醛固定液|4g多聚甲醛+100mL PBS，加热溶解（通风橱操作），固定细胞结构
|透化液（0.1%Triton X-100）|1mL Triton X-100+999mL PBS，让抗体能进入细胞
|封闭液（1%BSA）|1g BSA+100mL PBS，减少背景干扰
|抗体稀释液|1%BSA+0.1%Tween-20的PBS溶液，稀释抗体
|DAPI染液（核染色）|1μg/mL DAPI（溶于PBS），标记细胞核
|抗荧光淬灭封片剂|甘油+PBS（9:1）+抗淬灭剂（如DABCO），延长荧光信号保存时间
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?四、实验设置
1️⃣实验设计：
• 阳性对照：已知表达目标蛋白的细胞。
• 阴性对照：不加一抗或用同型IgG替代，排除假阳性。
2️⃣抗体选择：
• 一抗要验证特异性（文献/WB验证），二抗要匹配一抗种属（如兔一抗→抗兔二抗）。
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?五、实验步骤
1️⃣细胞准备：细胞爬片，接种至60%70%密度。
2️⃣固定与透化：4%多聚甲醛固定15分钟→0.1%Triton X-100透化10分钟。
3️⃣封闭：1%BSA封闭30分钟。
4️⃣一抗孵育：4℃过夜或室温2小时。
5️⃣二抗孵育：室温1小时，避光。
6️⃣核染色：DAPI染5分钟，避光。
7️⃣封片与观察：抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察（尽快拍照）。
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?六、结果分析
1️⃣定性分析：看蛋白的荧光颜色和位置（膜/质/核）。
2️⃣定量分析：用ImageJ软件测荧光强度，统计阳性细胞比例
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⚠️七、注意事项
1️⃣避光操作：二抗孵育后全程避光，防止荧光淬灭。
2️⃣抗体保存：分装后-20℃保存，避免反复冻融。
3️⃣封片技巧：封片剂避免气泡，用量适中。
4️⃣对照设置：必须有阳性和阴性对照。
5️⃣洗涤充分：每次洗涤要彻底，减少背景噪音。
6️⃣细胞状态：避免细胞过度生长或死亡。
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?八、优缺点对比
见图
#细胞免疫荧光 #实验技巧 #蛋白定位
简单来说，就是用荧光标记抗体去“钓”目标蛋白，通过荧光显微镜观察蛋白的位置和表达。
• 直接法：一抗直接带荧光，步骤少但成本高。
• 间接法：二抗带荧光，信号更强，灵敏度更高。
关键工具：荧光显微镜、特异性抗体、固定和透化处理。
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?二、主要用途
1️⃣蛋白定位：看蛋白在细胞的哪个位置（膜上、核里）。
2️⃣共定位研究：两种蛋白是否“住”在一起（比如线粒体和凋亡蛋白）。
3️⃣疾病诊断：检测病毒抗原（HPV）或自身免疫病抗体。
4️⃣药物研究：看药物对蛋白的影响。
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?三、溶液配制
|4%多聚甲醛固定液|4g多聚甲醛+100mL PBS，加热溶解（通风橱操作），固定细胞结构
|透化液（0.1%Triton X-100）|1mL Triton X-100+999mL PBS，让抗体能进入细胞
|封闭液（1%BSA）|1g BSA+100mL PBS，减少背景干扰
|抗体稀释液|1%BSA+0.1%Tween-20的PBS溶液，稀释抗体
|DAPI染液（核染色）|1μg/mL DAPI（溶于PBS），标记细胞核
|抗荧光淬灭封片剂|甘油+PBS（9:1）+抗淬灭剂（如DABCO），延长荧光信号保存时间
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?四、实验设置
1️⃣实验设计：
• 阳性对照：已知表达目标蛋白的细胞。
• 阴性对照：不加一抗或用同型IgG替代，排除假阳性。
2️⃣抗体选择：
• 一抗要验证特异性（文献/WB验证），二抗要匹配一抗种属（如兔一抗→抗兔二抗）。
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?五、实验步骤
1️⃣细胞准备：细胞爬片，接种至60%70%密度。
2️⃣固定与透化：4%多聚甲醛固定15分钟→0.1%Triton X-100透化10分钟。
3️⃣封闭：1%BSA封闭30分钟。
4️⃣一抗孵育：4℃过夜或室温2小时。
5️⃣二抗孵育：室温1小时，避光。
6️⃣核染色：DAPI染5分钟，避光。
7️⃣封片与观察：抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察（尽快拍照）。
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?六、结果分析
1️⃣定性分析：看蛋白的荧光颜色和位置（膜/质/核）。
2️⃣定量分析：用ImageJ软件测荧光强度，统计阳性细胞比例
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⚠️七、注意事项
1️⃣避光操作：二抗孵育后全程避光，防止荧光淬灭。
2️⃣抗体保存：分装后-20℃保存，避免反复冻融。
3️⃣封片技巧：封片剂避免气泡，用量适中。
4️⃣对照设置：必须有阳性和阴性对照。
5️⃣洗涤充分：每次洗涤要彻底，减少背景噪音。
6️⃣细胞状态：避免细胞过度生长或死亡。
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?八、优缺点对比
见图
#细胞免疫荧光 #实验技巧 #蛋白定位
