?前期准备
准备空孔板，将爬片放入其中，加入细胞和培养液，过夜等待细胞贴壁后，开始进行造模或加药处理。（这一步是实验的基础，细胞状态好，后续结果才会漂亮）
?操作步骤（以下以24孔板为例）
1️⃣ 清洗：小心倒弃培养基，每孔用1X PBS清洗3次，每次5分钟。
2️⃣ 固定：每孔加入300uL 4%多聚甲醛，室温固定20分钟。
3️⃣ 二次清洗：吸弃多聚甲醛后，PBS再清洗3次，每次10分钟。
4️⃣ 破膜：每孔加入300uL含0.1%～0.3% TritonX - 100的PBS溶液，室温放置10分钟 ，为抗体进入细胞打开通道。
5️⃣ 封闭：吸弃破膜液，每孔加入用PBS稀释的10%山羊血清200uL，室温封闭30分钟，减少非特异性结合。
6️⃣ 孵育一抗：取出爬片放在玻片上（先在玻片上贴一层封口膜），每张爬片滴加50uL用1%山羊血清稀释的一抗，4℃孵育过夜。放入湿盒，加水保持湿润环境。
7️⃣ 回收一抗：小心将爬片挑回孔板（方便清洗干净），回收的一抗冻存于-20℃冰箱。
8️⃣ 三次清洗：PBS清洗3次，每次10分钟，洗去未结合的一抗。
9️⃣ 孵育荧光二抗：取出爬片置于玻片上，每张爬片滴加50uL用1%山羊血清稀释的二抗，室温孵育1小时，同样采用倒扣法 【这一步开始全程避光】。
? 回收二抗：和回收一抗操作一样，将爬片挑回孔板，回收的二抗冻存于-20℃冰箱 【全程避光】。
1️⃣1️⃣ 清洗：PBS清洗3次，每次5分钟【避光】。
1️⃣2️⃣ 核染色：每孔加入 DAPI（按说明书比例），室温孵育10分钟，稍微左右倾倒摇晃，让DAPI均匀覆盖【避光】。
1️⃣3️⃣ 清洗和封片：PBS清洗3～5次，每次5分钟。取出爬片沥干液体，向载玻片上滴加10μl防荧光淬灭剂，将爬片倒扣于载玻片上，在阴凉避光处完成封片，4℃冰箱避光保存【避光】。
1️⃣4️⃣ 拍片。
?小tips：
从孵育荧光二抗开始整个实验过程尽量避光，防止荧光淬灭。
抗体孵育时一定要保证样本处于湿润环境。
不同的一抗、二抗，可能需要摸索优化孵育条件。
#细胞实验 #免疫荧光 #生物医学科研 #科研学习
准备空孔板，将爬片放入其中，加入细胞和培养液，过夜等待细胞贴壁后，开始进行造模或加药处理。（这一步是实验的基础，细胞状态好，后续结果才会漂亮）
?操作步骤（以下以24孔板为例）
1️⃣ 清洗：小心倒弃培养基，每孔用1X PBS清洗3次，每次5分钟。
2️⃣ 固定：每孔加入300uL 4%多聚甲醛，室温固定20分钟。
3️⃣ 二次清洗：吸弃多聚甲醛后，PBS再清洗3次，每次10分钟。
4️⃣ 破膜：每孔加入300uL含0.1%～0.3% TritonX - 100的PBS溶液，室温放置10分钟 ，为抗体进入细胞打开通道。
5️⃣ 封闭：吸弃破膜液，每孔加入用PBS稀释的10%山羊血清200uL，室温封闭30分钟，减少非特异性结合。
6️⃣ 孵育一抗：取出爬片放在玻片上（先在玻片上贴一层封口膜），每张爬片滴加50uL用1%山羊血清稀释的一抗，4℃孵育过夜。放入湿盒，加水保持湿润环境。
7️⃣ 回收一抗：小心将爬片挑回孔板（方便清洗干净），回收的一抗冻存于-20℃冰箱。
8️⃣ 三次清洗：PBS清洗3次，每次10分钟，洗去未结合的一抗。
9️⃣ 孵育荧光二抗：取出爬片置于玻片上，每张爬片滴加50uL用1%山羊血清稀释的二抗，室温孵育1小时，同样采用倒扣法 【这一步开始全程避光】。
? 回收二抗：和回收一抗操作一样，将爬片挑回孔板，回收的二抗冻存于-20℃冰箱 【全程避光】。
1️⃣1️⃣ 清洗：PBS清洗3次，每次5分钟【避光】。
1️⃣2️⃣ 核染色：每孔加入 DAPI（按说明书比例），室温孵育10分钟，稍微左右倾倒摇晃，让DAPI均匀覆盖【避光】。
1️⃣3️⃣ 清洗和封片：PBS清洗3～5次，每次5分钟。取出爬片沥干液体，向载玻片上滴加10μl防荧光淬灭剂，将爬片倒扣于载玻片上，在阴凉避光处完成封片，4℃冰箱避光保存【避光】。
1️⃣4️⃣ 拍片。
?小tips：
从孵育荧光二抗开始整个实验过程尽量避光，防止荧光淬灭。
抗体孵育时一定要保证样本处于湿润环境。
不同的一抗、二抗，可能需要摸索优化孵育条件。
#细胞实验 #免疫荧光 #生物医学科研 #科研学习
