免疫荧光染色有哪些技术要点
一、技术分类
1. 直接免疫荧光
原理：荧光素直接标记一抗，与靶抗原结合后直接观察。
优点：步骤简单，非特异性结合少。
缺点：灵敏度较低，一抗需单独标记。
2. 间接免疫荧光
◦ 原理：一抗与抗原结合后，荧光素标记的二抗（针对一抗）再结合。
◦ 优点：信号放大，灵敏度高，通用性强。
◦ 缺点：步骤较多，可能增加背景噪声。
二、关键实验步骤及要点
1. 样本制备
• 细胞样本：
◦ 贴壁细胞：4%多聚甲醛固定（10-15分钟），透膜（0.1% Triton X-100，5分钟）。
◦ 悬浮细胞：离心后涂片，避免细胞丢失。
• 组织样本：
◦ 石蜡切片需脱蜡、水化；冰冻切片直接固定，注意防脱片。
• 关键点：
◦ 避免过度固定（抗原表位可能被掩盖）。
◦ 透膜时间需优化（过度透膜破坏细胞结构）。
2. 抗体孵育
• 一抗选择：
◦ 验证特异性（KO样本或Western Blot确认）。
◦ 稀释比例需预实验（常用1:100-1:500）。
• 孵育条件：
◦ 4℃过夜（特异性结合更佳）或室温1-2小时。
◦ 湿盒内操作，防止干燥。
• 二抗选择：
匹配一抗种属。
避免交叉反应。
3. 荧光标记与检测
• 荧光素选择：
◦ 常用：FITC（绿色）、Cy3（红色）、DAPI（蓝色核染）。
◦ 多色实验：选择光谱不重叠的荧光素（如Alexa Fluor系列）。
• 封片：
◦ 抗淬灭封片剂，延缓荧光衰减。
• 关键点：
◦ 避光操作（防止荧光淬灭）。
◦ 设置阴性对照（未加一抗或同型对照）。
三、常见问题及解决方案
1. 高背景噪声
◦ 原因：抗体浓度过高、非特异性结合、样本自发荧光。
◦ 解决：优化抗体稀释度，增加封闭时间（5% BSA或血清），缩短曝光时间。
2. 信号弱或无信号
◦ 原因：抗原表位被破坏、抗体失效、荧光淬灭。
◦ 解决：更换固定方法（如甲醇替代多聚甲醛），验证抗体活性，新鲜配制荧光二抗。
3. 非特异性染色
◦ 原因：二抗交叉反应、内源性IgG结合。
◦ 解决：使用种属特异性二抗，预吸附二抗或阻断内源性IgG（如山羊血清）。
4. 荧光淬灭快
◦ 原因：封片不当或光照过度。
◦ 解决：使用抗淬灭剂，避光保存样本。
一、技术分类
1. 直接免疫荧光
原理：荧光素直接标记一抗，与靶抗原结合后直接观察。
优点：步骤简单，非特异性结合少。
缺点：灵敏度较低，一抗需单独标记。
2. 间接免疫荧光
◦ 原理：一抗与抗原结合后，荧光素标记的二抗（针对一抗）再结合。
◦ 优点：信号放大，灵敏度高，通用性强。
◦ 缺点：步骤较多，可能增加背景噪声。
二、关键实验步骤及要点
1. 样本制备
• 细胞样本：
◦ 贴壁细胞：4%多聚甲醛固定（10-15分钟），透膜（0.1% Triton X-100，5分钟）。
◦ 悬浮细胞：离心后涂片，避免细胞丢失。
• 组织样本：
◦ 石蜡切片需脱蜡、水化；冰冻切片直接固定，注意防脱片。
• 关键点：
◦ 避免过度固定（抗原表位可能被掩盖）。
◦ 透膜时间需优化（过度透膜破坏细胞结构）。
2. 抗体孵育
• 一抗选择：
◦ 验证特异性（KO样本或Western Blot确认）。
◦ 稀释比例需预实验（常用1:100-1:500）。
• 孵育条件：
◦ 4℃过夜（特异性结合更佳）或室温1-2小时。
◦ 湿盒内操作，防止干燥。
• 二抗选择：
匹配一抗种属。
避免交叉反应。
3. 荧光标记与检测
• 荧光素选择：
◦ 常用：FITC（绿色）、Cy3（红色）、DAPI（蓝色核染）。
◦ 多色实验：选择光谱不重叠的荧光素（如Alexa Fluor系列）。
• 封片：
◦ 抗淬灭封片剂，延缓荧光衰减。
• 关键点：
◦ 避光操作（防止荧光淬灭）。
◦ 设置阴性对照（未加一抗或同型对照）。
三、常见问题及解决方案
1. 高背景噪声
◦ 原因：抗体浓度过高、非特异性结合、样本自发荧光。
◦ 解决：优化抗体稀释度，增加封闭时间（5% BSA或血清），缩短曝光时间。
2. 信号弱或无信号
◦ 原因：抗原表位被破坏、抗体失效、荧光淬灭。
◦ 解决：更换固定方法（如甲醇替代多聚甲醛），验证抗体活性，新鲜配制荧光二抗。
3. 非特异性染色
◦ 原因：二抗交叉反应、内源性IgG结合。
◦ 解决：使用种属特异性二抗，预吸附二抗或阻断内源性IgG（如山羊血清）。
4. 荧光淬灭快
◦ 原因：封片不当或光照过度。
◦ 解决：使用抗淬灭剂，避光保存样本。
