24孔板试验一个抗体的三个浓度。
1. 细胞培养后，取出细胞房，弃培液。
2.每个孔加入300微升的多聚甲醛。固定不动20分钟。
3.加入500ul pbs漂洗两遍，每遍五分钟。摇床转速约60。
4.加入5%的triton，300ul ，打孔通透15分钟。
5.同样pbs漂洗两遍。(3-5步骤中想要暂停实验，可以细胞泡在pbs中放4度保存，一周没问题，注意液体不要蒸发干掉)
6.封闭: 加入300微升的5%山羊血清。室温封闭1小时，摇床转速约30-40。封闭液配方示例: 8ml pbst + 400ul 山羊血清，得到8ml的封闭液。
7. pbs漂洗一遍。
8.一抗孵育: 加入250ul的一抗，室温孵育两小时，或者四度孵育过夜。抗体用5%的BSA配配制。(首次试验采用1:50，1:100，1:200，寻找适合浓度)
9.抗体回收，加入pbs漂洗3遍。
10.二抗孵育: 加入250ul 二抗室温孵育1小时，1:1000比例，用5%的bsa配制。二抗后面步骤避光，可以用锡箔纸包住孔板。
11.pbs漂洗3遍。
12.染核: 加入dapi 1:2000，pbs配制，250ul每孔，室温避光孵育五分钟。
13.弃去dapi，pbs漂洗一遍，最后加入250~300ul pbs，放上荧光显微镜拍照。
注意:
1如果发现贴壁细胞拍照时形态变圆，触角收起，可能是因为加入多聚甲醛固定前加了冰冷pbs，使得细胞形态改变。可以去培养基后直接加多聚甲醛，不需要pbs漂洗。
2如果是正式实验，可以在孔板铺细胞前加入细胞爬片: 孔板底部加入10ul培养基，再用镊子夹住爬片放入孔板中。细胞铺板后如果爬片有点飘起来，可以用枪头往下按。
3 封闭液用血清种属根据二抗，二抗选择根据一抗。比如小鼠细胞，一抗是rabbit anti mouse，二抗选择af488 goat anti rb。
4染完尽快拍照，如果是爬片的话要加入荧光淬灭剂封片。
#细胞实验 ＃免疫荧光
1. 细胞培养后，取出细胞房，弃培液。
2.每个孔加入300微升的多聚甲醛。固定不动20分钟。
3.加入500ul pbs漂洗两遍，每遍五分钟。摇床转速约60。
4.加入5%的triton，300ul ，打孔通透15分钟。
5.同样pbs漂洗两遍。(3-5步骤中想要暂停实验，可以细胞泡在pbs中放4度保存，一周没问题，注意液体不要蒸发干掉)
6.封闭: 加入300微升的5%山羊血清。室温封闭1小时，摇床转速约30-40。封闭液配方示例: 8ml pbst + 400ul 山羊血清，得到8ml的封闭液。
7. pbs漂洗一遍。
8.一抗孵育: 加入250ul的一抗，室温孵育两小时，或者四度孵育过夜。抗体用5%的BSA配配制。(首次试验采用1:50，1:100，1:200，寻找适合浓度)
9.抗体回收，加入pbs漂洗3遍。
10.二抗孵育: 加入250ul 二抗室温孵育1小时，1:1000比例，用5%的bsa配制。二抗后面步骤避光，可以用锡箔纸包住孔板。
11.pbs漂洗3遍。
12.染核: 加入dapi 1:2000，pbs配制，250ul每孔，室温避光孵育五分钟。
13.弃去dapi，pbs漂洗一遍，最后加入250~300ul pbs，放上荧光显微镜拍照。
注意:
1如果发现贴壁细胞拍照时形态变圆，触角收起，可能是因为加入多聚甲醛固定前加了冰冷pbs，使得细胞形态改变。可以去培养基后直接加多聚甲醛，不需要pbs漂洗。
2如果是正式实验，可以在孔板铺细胞前加入细胞爬片: 孔板底部加入10ul培养基，再用镊子夹住爬片放入孔板中。细胞铺板后如果爬片有点飘起来，可以用枪头往下按。
3 封闭液用血清种属根据二抗，二抗选择根据一抗。比如小鼠细胞，一抗是rabbit anti mouse，二抗选择af488 goat anti rb。
4染完尽快拍照，如果是爬片的话要加入荧光淬灭剂封片。
#细胞实验 ＃免疫荧光
