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随着合成生物学的兴起，无细胞蛋白合成（CFPS）系统在对基因网络和生物合成途径理解方面的发展中占据了科学地位。CFPS系统的进行需要RNA聚合酶的核心机制，翻译装置（核糖体，tRNA合成酶和翻译因子），能量生成分子及其辅助因子，底物以及DNA或质粒模板，以获得所需的产物。CFPS目前已被用于许多实验，包括生产与有毒氨基酸（如canavanine）结合的蛋白质，引入正交遗传密码，生产治疗药物，测试复杂的基因网络，组装噬菌体等等。今天小编将介绍CFPS的应用方向及最新进展。
图1：单管中CFPS系统的示意图
医疗保健
蛋白质产品在当今的医疗保健领域发挥着至关重要的作用。用于生物制药和工业领域的很大一部分蛋白质难以表达，因为它们通常过于复杂和有毒，或者属于难以使用活细胞生产的膜蛋白。因此，CFPS系统的主要目标是调节和优化体外蛋白质生产。
高水平的蛋白质毒性可导致活细胞在体内的基因克隆和表达过程中死亡。并且有毒蛋白质会干扰代谢生物合成途径，并倾向于抑制细胞分裂。因此，它们很难在胞内大量表达。一些剧毒蛋白质已经从无细胞系统中表达和纯化，包括限制性核酸内切酶，细胞致死性扩张毒素和人微管结合蛋白。由于不依赖于细胞生长和分裂，CFPS系统可以用作毒素生产的替代平台。
膜蛋白由于其结构复杂、潜在毒性、制备繁琐和效率低下，这种蛋白质的体内过表达仍然是研究进展的关键瓶颈，但是因其作为药物靶标的潜力而持续受到研究人员的关注，许多研究表明，CFPS系统可用于膜蛋白的过表达，许多膜蛋白的表达被成功证明，其中包括G蛋白偶联受体，疫苗抗原和四环素泵TetA。此外，一种可以作为可能的抗代谢物和有机化感剂的精氨酸类似物,非天然剧毒（在活细胞的背景下）氨基酸canavanine，已经成功通过CFPS系统进行表达。
治疗性蛋白
CFPS已被认可为生产治疗性蛋白质的可行选择。在以大肠杆菌细胞提取物作为无细胞系统的合成体系下，已经合成了很多复杂的蛋白质，例如尿激酶蛋白酶和人类组织型纤溶酶原激活剂的变体（分别含有六个和九个二硫键）。
尿激酶蛋白酶的治疗重要性与其作为溶栓剂的活性有关，有助于治疗血栓相关疾病。尿激酶蛋白酶的关键作用是将纤溶酶原转化为纤溶酶，这一步骤有助于溶解血凝块。同样，组织纤溶酶原激活剂的变体有可能用作治疗急性缺血性中风的药物。
虽然细胞裂解物中二硫键的还原活性使得蛋白质中难以形成二硫键。但可以通过设计一种适应性的方法来解决，其中细胞提取物在开始蛋白质合成反应之前可以先用碘乙酰胺处理，用以消除细胞裂解物中存在的二硫键的还原活性。此外，还可以在反应体系中使用纯化的二硫异构酶DsbC和谷胱甘肽氧化还原缓冲液可以形成活性尿激酶蛋白酶（0.04mg / mL），其最终表达结构中含有六个二硫键。
表1：CFPS系统生产的治疗性蛋白质
新药研发
无细胞蛋白表达技术在新药研发过程中也扮演着重要的角色。许多药物的研发依赖于对蛋白质的合成和研究。传统的细胞表达系统可能受限于蛋白质的复杂性和表达量的限制，而无细胞蛋白表达系统则能够高效地合成各种类型的蛋白质，包括药物靶点蛋白和重组蛋白药物。这为快速发现和开发新药提供了一种可行的方法。
图 2：无细胞蛋白质合成系统在医药健康领域的应用
生物保护
生物防护是生物安全的一个方面，涉及可能对人类健康和生态构成风险的生物和物种，具体涵盖其在安全区域内的物理遏制，以禁止其释放到更广泛的社区。尽管应用广泛并取得了巨大成功，但当前的许多生物遏制策略可能不足以应对现代挑战，尤其是在新型转基因和/或转基因生物的释放和传播方面。因此，迫切需要开发新技术，以应对威胁生物安全和生物安保的生物遏制风险，这些技术最终将有助于大幅降低转基因生物体带来的潜在严重性和危险性。
在迄今为止已经提出了许多涉及无细胞系统的策略。以CFPS系统获取蛋白质的好处源于它们保持非生物的能力，许多使用这些系统的实用程序已经取得了成功，包括治疗药物的生物合成和将转录/翻译机器封装成囊泡。在所有情况下，使用CFPS系统意味着实验过程表现出比生命系统更低的生物安全风险，而生命系统通常可能是无细胞系统的一个被低估的方面。
产业应用
无细胞蛋白表达技术在产业应用中具有广泛的潜力。传统的细胞表达系统在工业生产中存在一些限制，如生长周期长、产量低、回收和纯化困难等。无细胞蛋白表达系统通过消除细胞的生长需求和代谢调控，可以显著提高蛋白质的合成效率和产量。这对于工业生产中的蛋白质表达和纯化具有重要意义，并有望推动生物制药和生物工程等领域的发展。
未来展望
随着合成生物学和无细胞蛋白表达技术的不断发展，人们对其未来的展望也越来越广泛。一方面，随着技术的进步，无细胞蛋白表达系统将变得更加高效、稳定和可控，为蛋白质的合成和定制提供更多的可能性。另一方面，与其他领域的交叉合作将会推动该技术的创新应用，如与人工智能、纳米技术和材料科学等的结合。这将促进无细胞蛋白表达技术在药物研发、工业生产和生物医学等领域的广泛应用。
总的来说，无细胞蛋白表达技术在合成生物学领域中的应用前景非常广阔，为抗体研发、药物筛选和疫苗研究提供了非常有力的支持。同时，随着技术的不断发展和改进，相信无细胞蛋白表达技术将在未来取得更广泛的应用和突破。通过解决技术挑战和改进系统性能并进一步推动无细胞蛋白表达技术的发展和应用，为合成生物学的发展提供了强有力的支持，做出更大的贡献。
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