CGT行业在我国发展迅猛，技术不断更新迭代。为了确保最终产品的安全性，企业必须要选择合适的，可以耐超低温的医药包材。由于许多原因，选择用于生物保藏的包装系统是至关重要的。理想的生物保存容器系统必须提供封闭的完整性、样品的稳定性和对保存材料的可获取性。这意味着系统需要密封，以确保在整个加工、储存和取样过程中保持样品的完整性；系统必须在长时间内保持稳定，因为许多生物库样品可以无限期地存储；并且必须使用功能封闭的进入系统以避免在样品提取时受到污染。本研究回顾了一种新型的超低温医药包材的适用性，该容器利用血袋式封闭和灌装系统，可以通过﹣196℃保存和生物库程序进行密封并保持稳定。这种基于小瓶的系统允许在样品处理期间满足当前良好的cGTP要求，并且便于医护人员的操作。在这项研究中，对CellSeal®Closed Cryogenic Vials进行了评估，并将其与标准的普通冻存管进行了比较。通过运输和维持冷冻保存的间充质干细胞模型的功能活力，评估CellSeal系统的耐用性、闭合完整性。这项验证研究的结果表明，CellSeal®Closed Cryogenic Vials非常适合生物保存和生物库，并为小体积冷冻的临床和商业细胞治疗产品提供了合适的容器。
无菌性测试---冷冻，运输，复苏
为了确保CellSeal®Closed Cryogenic Vials能够通过冷冻、储存、运输和解冻过程保持封闭完整性，Sexton公司与外部合同测试实验室（Nelson Labs，Salt Lake City，UT，USA）一起进行了容器封闭完整性研究（染料进入和微生物挑战测试）。
对于染料浸渍测试，用含有10%DMSO的等渗PBS溶液填充小瓶，并密封管路。为了进行无菌维持试验，用胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）填充小瓶，然后适当关闭。在运送进行测试之前，将小瓶控制冷却至–85°C，然后放入–196°C的液氮罐中。1周后，将小瓶运送到Nelson实验室。在实验室收到样品后，将样品在37°C的水浴中解冻，直到最后一块冰融化，然后擦拭并风干以进行测试。染料浸渍试验通过将小瓶浸入亚甲基蓝染料和聚山梨酯（Tween®）80的溶液中并施加压差来进行。使用UV/Vis分光光度计检查每个小瓶的内容物是否有染料渗透的证据。如果样品的最大吸光度小于用于确定检测限的样品的最大吸光率，则小瓶通过。接下来，为了评估低温储存和运输后TSB填充小瓶的微生物屏障特性，将小瓶在37°C水浴中解冻，使其达到室温，并通过将其浸入（ATCC）#19146的短殖单胞菌的微生物挑战“浴”中指定的时间进行测试，同时使测试样品经受压力变化。当在精心控制的条件下生长时，选择B.diminutaas作为挑战生物是基于其非常小的体积。由于挑战溶液中生物体的大小和浓度，B.diminuta代表了最严格的细菌挑战。然后将小瓶从微生物激发溶液中取出，冲洗、孵育并检查激发生物的生长。培养后在选定的无菌容器上进行抑菌试验，以证明试验系统和材料不会抑制挑战生物体的生长。通过使用22号针头在顶部小瓶中刺穿一个孔来进行阳性对照。然后以与测试容器相同的方式对阳性对照进行测试。阴性对照由未暴露于激发溶液的填充测试样品组成。
在-196ºC下冷冻、储存和运输的所有小瓶均未检测到染料渗透的证据。此外，每个CellSeal®Closed Cryogenic Vials都通过了完整性测试，并在挑战测试时产生无菌流出物。阳性对照组同时具有染料和细菌渗透性，而阴性对照组没有染料或细菌渗透性来验证测试方法的有效性。
性能测试---MSC
作为干细胞模型，使用从人牙髓组织中分离的间充质干细胞（MSC）群体，其在基因表达谱和细胞表面标记物表达方面具有与骨髓MSC相似的特征。这些牙髓衍生的MSC（或DPSC）在我们的实验室中已经得到了很好的表征，并具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和神经细胞的能力。MSC和DPSC在组织再生和细胞治疗中的潜在用途引起了人们的极大兴趣。Sexton公司和其他人已经证明，DPSC可以被成功冷冻保存和解冻，并具有良好的功能活力。由于这些特性及其现成的可用性，低传代的DPSC培养物被用于评估CellSeal®Closed Cryogenic Vials的性能，以维持冷冻保存的细胞模型。对于这些实验，使用标准的普通冻存管作为对照。
如别处所述，分离并扩增人DPSC干细胞。简言之，使用当地口腔手术组的标准技术提取18-26岁男性和女性的人类第三磨牙。将丢弃的、未识别的牙齿放入低温保存介质中，并在提取当天快递至实验室。一到实验室，DPSC就被分离和培养。在第7天对原代新鲜细胞培养物的菌落形成进行评分，一旦约70%融合，使用胰蛋白酶/EDTA溶液收获这些建立的原代DPSC培养物。通过流式细胞术和多谱系分化能力将这些建立的DPSC培养物确认为MSC，并且在下述实验中使用来自至少4个供体的早期传代细胞。
冻融细胞表现出快速恢复，细胞开始粘附在培养瓶上，并在解冻后2小时内恢复形态。所有培养物在4-6天内融合约70%，这与我们之前的工作一致，与非冷冻对照相似，表明储存在两个小瓶中的DPSCs的增殖潜力恢复。通过视觉观察，在任何培养物中都没有明显的污染。
平均而言，解冻后的细胞在CellSeal®Closed Cryogenic Vials中冷冻需要3-5天，在对照组普通冻存管中冷冻需要3-6天才能达到70-80%的融合。这些值在统计上相互一致，也与冷冻前的值一致。
