单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）是一种革兰氏阳性食源性病原菌，是李斯特菌属的一种。一些研究报告称，最常由李斯特菌引起污染的食物包括肉类、牛奶、水产品和蔬菜，尤其是以肉类和肉制品为甚。超高压（HPP）是一种非热加工技术，通过高压改变微生物细胞的形态，造成蛋白质（酶）的不可逆损伤以及细胞内容物的积累，最终导致微生物死亡。HPP可以在不添加化学防腐剂的情况下达到保鲜以及最低限度加工食品中病原菌的要求。月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐（LAE）是一种具有广谱抑菌性的阳离子表面活性剂，它与带负电的微生物细胞表面有强相互作用，可以诱导微生物的电位紊乱和结构变化，进一步影响微生物代谢过程，但仍不足以引起细胞裂解。Listeria innocua为李斯特菌属的一种非致病菌，与致病性的单增李斯特菌具有共同的毒力祖先，四川成都中农大现代农业产业研究院的陈君玉、吴晓蒙*和中国农业大学李婷等人在研究单独LAE处理或与HPP结合对L. innocua的影响，讨论LAE结合HPP在食品中用于控制食源性微生物的潜力，为食品中单增李斯特菌的有效控制提供科学依据。
图1显示了不同质量浓度的LAE处理L. innocua 24 h的吸光度变化，表1显示了不同LAE质量浓度处理对L. innocua生长的影响。可以看出，LAE对L. innocua的MIC值为12 mg/L，MBC为16 mg/L。
图2显示了LAE对L. innocua的时间-杀菌曲线。对照组L. innocua生长正常，而LAE质量浓度高于MIC时，LAE对L. innocua具有持续杀灭作用，质量浓度越高、杀菌时间越长，杀菌效果越显著。当LAE质量浓度为MIC时，60 min内L. innocua活菌数降低了3.12（lg（CFU/mL）），随后的90 min内仅降低0.55（lg（CFU/mL）），说明60 min内LAE即可对L. innocua产生较强的杀灭的作用。当质量浓度达到2×MIC时，在短时间内对L. innocua的致死率为100%。虽然LAE的杀菌效果因其纯度、微生物种类等各异，但总体而言，LAE在短时间内即能对微生物产生较好的杀灭作用。
由表2可知，当NaCl质量浓度低于8.0 g/100 mL时，在37 ℃培养48 h后，对L. innocua的生长无影响；而当NaCl质量浓度大于8.0 g/100 mL 时，L. innocua的生长受到抑制。因而选取质量浓度为8.0 g/100 mL NaCl为L. innocua的亚损伤盐质量浓度，设置该质量浓度下的培养基为选择性培养基。
如图3A所示，在常压下，当LAE质量浓度为3、6、9 mg/L时，在选择培养基和非选择培养基上菌落减少数无显著差异，而当LAE质量浓度为MIC，即12 mg/L明，在选择性培养基上，LAE处理导致L. innocua的数量降低了2.96（lg（CFU/mL）），而使用非选择培养基仅降低了1.33（lg（CFU/mL）），这也证明了LAE能够对细菌的细胞膜产生作用造成细胞亚损伤；而250 MPa高压并未对L. innocua表现出明显的杀菌活性，可能较小的压力不足以导致细胞壁的完全破坏，但部分LAE处理组中出现了亚致死损伤（图3B）。随着压力的增加，杀菌效果逐渐增强。实验发现，在300 MPa压力处理下，添加LAE导致L. innocua在选择性培养基和非选择性培养基上的生长表现出显著性差异，仅压力作用时，在非选择性培养基上观察到菌落数降低0.33（lg（CFU/mL）），而与12 mg/L LAE联合即可使L. innocua的数量降低3.03（lg（CFU/mL））（图3C）；仅350 MPa高压作用5 min，菌落数在非选择性培养基上降低了1.62（lg（CFU/mL）），而与12 mg/L抗菌剂结合明能降低4.87（lg（CFU/mL）），分别比单独高压、单独LAE处理提高了3.25、3.54（lg（CFU/mL）），且对所有细胞造成损伤或亚致死损伤（图3D），这可能是由于LAE的主要作用位点在细胞膜上，它可以通过阳离子的胍基与带负电的细胞膜结合，引起细胞膜功能性的改变。基于LAE的作用，HPP进一步破坏微生物细胞膜的完整性，使得包括营养吸收和代谢废物清除在内的正常代谢途径受损，最终导致微生物的灭活，而加压造成的细菌细胞膜损伤可以提高细菌对小分子抗菌剂的敏感性，从而使两者表现出协同杀菌作用。由此可见，抗菌剂可以有效降低HPP的加工强度，与单独应用HPP处理相比，将HPP与抗菌剂结合具有更优异的杀菌效果，能实现较低压力下杀灭具有高压抗性的微生物，有较好的应用前景。
因300 MPa处理下L. innocua在选择性和非选择性培养基上的生长已产生显著差别，同明，与常压添加12 mg/L LAE相比，300 MPa下添加12 mg/L LAE处理组具有更为明显的杀菌效果，因而后续选择300 MPa压力和12 mg/L LAE处理的微生物进行实验。由图4A所示，未处理组的L. innocua细胞呈规则的杆状，表面光滑。经300 MPa高压处理5 min后，细胞形态并未发生显著变化，仅部分细胞表面出现轻微皱缩、孔隙，细胞变得粗糙（图4B），这是由于L. innocua的肽聚糖层使其具有一定的耐压性。然而，L. innocua对LAE较为敏感，常压下经12 mg/L LAE处理后，细胞表面出现较为明显的皱缩、凹陷等现象，内容物流出，但并未出现明显的细胞裂解现象（图4C）。当LAE与HPP联合后，细胞皱缩、凹陷更为明显，且有细胞内容物被观察到（图4D），呈现出协同杀菌效果。超高压和抗菌剂联合对L. innocua细胞通透性的影响
基于上述研究，利用SYTO9与PI对细胞染色，定量分析细胞膜通透性。SYTO9是一种可以透过所有细胞的细胞膜的绿色荧光核酸染料，而PI仅能透过通透性发生改变的细胞膜，并与SYTO9竞争结合位点，使膜受损细胞呈现红色荧光。如图5A所示，未经LAE及高压处理组99.1%的细胞呈现绿色荧光，显示出细胞膜具有良好的完整性。而经LAE处理后，细胞膜通透性改变，12 mg/L LAE处理即可使34.2%的L. innocua因细胞膜通透性发生改变而被PI染色（图5C），表明LAE通过改变细胞膜通透性而使细胞失活。L. innocua具有耐压性，因此单独施加300 MPa高压后仍有87.8%的细胞仅被SYTO9染色，细胞膜具有完整性（图5B）。但与LAE联合处理后细胞通透性发生明显变化，使PI染色细胞比例由9.99%提升至69.6%（图5D），高于两者单独作用之和，证明了LAE与HPP联合具有协同杀菌效果。选取火腿作为实验对象，测定不同LAE含量与300 MPa高压联合作用对L. innocua生长的影响，图6所示，以不添加LAE的常压处理组作为对照（菌落减少数为0），100 mg/kg LAE处理使得菌落数降低0.29（lg（CFU/g）），500 mg/kg LAE处理也仅使菌落数降低2.04（lg（CFU/g）），因LAE作为一种表面活性剂，易与脂肪、碳水化合物、蛋白质等食物成分发生反应，复杂的食品基质易降低LAE的抗菌效果，因而火腿中L. innocua数的减少程度远不如其在肉汤中的减少量。300 MPa高压与100 mg/kg LAE联合处理可使菌落数降低1.35（lg（CFU/g）），比单独高压处理提高了1.19（lg（CFU/g）），比单独100 mg/kg LAE处理提高了1.06（lg（CFU/g）），表明LAE与HPP具有协同杀菌作用。而500 mg/kg LAE与高压的联合处理其杀菌结果比单独高压处理提高了2.27（lg（CFU/g）），比单独500 mg/kg LAE处理提高了0.39（lg（CFU/g）），也说明HHP与LAE具有协同杀菌作用，但一方面，FDA批准LAE作为食品防腐剂最高含量仅为200 mg/kg，欧盟立法中LAE作为食品添加剂用于熟肉制品中最大含量为160 mg/kg。另一方面，不同含量LAE与高压联合处理相比于同含量下单独LAE处理杀菌效果，100 mg/kg LAE与高压联合处理明菌落减少数更多，因而300 MPa高压与100 mg/kg LAE联合处理具有更优异的协同杀菌效果。本研究将LAE和HPP联合以探究其协同杀菌效果及可能机制，并以火腿作为研究对象，探究HPP与LAE联合处理在实际食品体系中的应用可行性。实验结果表明，LAE与HPP联合使用对L. innocua的杀菌效果优于单独使用，具有协同杀菌作用。在12 mg/L LAE的存在下，350 MPa处理5 min即可使L. innocua菌液中的菌落数降低4.87（lg（CFU/mL））。通过细胞形态和膜通透性变化结果也证实了细胞膜可能是HPP和LAE对L. innocua产生协同作用的原因，此明对细胞膜产生了更严重的损伤，提高了细菌对小分子抗菌剂的敏感性，阻止了更多亚致死损伤细胞的恢复。为了验证其应用性，将两者联合应用于火腿也表现出协同杀菌作用。研究结果为控制即食肉制品中食源性病原菌的生长提供理论参考。专家简介：
2014年获得美国佐治亚大学食品科学博士学位，2015—2016年于世界500强企业希悦尔公司美国研发部任高级应用专家，从事新型食品包装的研发工作。2017年由中国农业大学“优秀人才”计划引进回国，入职食品科学与营养工程学院，在国家果蔬加工工程技术研究中心团队工作，目前主要致力于食品加工与中餐工业化研究。近年来，主持国家重点研发计划、四川省自然科学基金等科研项目10余项，累计发表论文50余篇，参与编写英文专著1 部，授权专利6 项。担任北京市预制菜质量标准化技术委员会委员，兼任《包装工程》《中国果菜》杂志青年编委。获得国家科学技术进步二等奖1 项、中国产学研合作创新成果奖一等奖1 项、神农中华农业科技奖优秀创新团队奖1 项、北京市教学成果二等奖1 项。本文《超高压联合月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐对Listeria innocua的杀菌效果》来源于《食品科学》2023年44卷23期37-44页. 作者：陈君玉，李婷，李想，饶雷，吴晓蒙. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230630-242. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
《食品科学》食品非热加工专栏：江苏大学邹小波、石吉勇教授等：米糠非热稳定化处理技术研究进展
