
鬼笔环肽可以特异性地与细胞内的丝状肌动蛋白(F-actin)结合,在荧光标记后可用于观察细胞内肌动蛋白细胞骨架的分布 ,以下是一个简短的细胞鬼笔环肽染色流程:
1. 细胞固定:将培养在盖玻片或培养皿中的细胞用合适的固定液(如4%多聚甲醛)固定15-20分钟,固定过程可使细胞形态保持稳定,且蛋白质交联,防止后续操作中细胞结构被破坏。
2. 透化处理:使用含有0.1% Triton X-100的PBS溶液处理细胞5-10分钟,以增加细胞膜的通透性,使鬼笔环肽能够进入细胞与F-actin结合。
3. 封闭:用含有1-5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭细胞30分钟,减少非特异性结合,降低背景染色。
4. 鬼笔环肽染色:按照合适的比例(如1:200 - 1:500,需根据产品说明书调整)用PBS稀释荧光标记的鬼笔环肽工作液,将稀释后的鬼笔环肽溶液滴加在细胞上,室温孵育30 - 60分钟,使鬼笔环肽与细胞内的F-actin特异性结合。
5. 洗涤:用PBS洗细胞3次,每次5-10分钟,以去除未结合的鬼笔环肽,减少背景干扰。
6. 封片与观察:将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封片,然后在荧光显微镜下观察,根据荧光信号定位F-actin在细胞中的分布。
染色过程中需注意,操作尽量在避光条件下进行,以防止荧光淬灭,同时要严格控制各步骤的时间和温度,保证实验结果的准确性和稳定性。
1. 细胞固定:将培养在盖玻片或培养皿中的细胞用合适的固定液(如4%多聚甲醛)固定15-20分钟,固定过程可使细胞形态保持稳定,且蛋白质交联,防止后续操作中细胞结构被破坏。
2. 透化处理:使用含有0.1% Triton X-100的PBS溶液处理细胞5-10分钟,以增加细胞膜的通透性,使鬼笔环肽能够进入细胞与F-actin结合。
3. 封闭:用含有1-5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭细胞30分钟,减少非特异性结合,降低背景染色。
4. 鬼笔环肽染色:按照合适的比例(如1:200 - 1:500,需根据产品说明书调整)用PBS稀释荧光标记的鬼笔环肽工作液,将稀释后的鬼笔环肽溶液滴加在细胞上,室温孵育30 - 60分钟,使鬼笔环肽与细胞内的F-actin特异性结合。
5. 洗涤:用PBS洗细胞3次,每次5-10分钟,以去除未结合的鬼笔环肽,减少背景干扰。
6. 封片与观察:将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封片,然后在荧光显微镜下观察,根据荧光信号定位F-actin在细胞中的分布。
染色过程中需注意,操作尽量在避光条件下进行,以防止荧光淬灭,同时要严格控制各步骤的时间和温度,保证实验结果的准确性和稳定性。