⭐前处理核心：心脏灌注法
为什么必须灌注？
①脑组织软易变形，灌注固定保形态；
②减少取脑损伤；
③冲净红细胞，避免染色干扰。
⭐操作步骤（大鼠版）：
1️⃣ 麻醉开胸：沿胸骨剪开胸腔，暴露心脏，左心室30-45°剪口插管至主动脉。与心尖呈30-45°夹角剪开左心室，将灌注针从左心室插入主动脉，固定针头，再剪开右心耳。
2️⃣ 冲血+固定：
生理盐水快速冲洗（100-150ml），
观察肝脏/爪子变白即血液排净✅；
4%多聚甲醛先快后慢灌注250ml(大鼠），
耗时约50min，
四肢抽搐&肝脏发白、内脏鼓起即成功。
3️⃣ 后固定：
取脑后浸4%多聚甲醛4℃冰箱12-24小时。
⚠️注意事项：
人工气胸：剪膈肌小口让肺萎缩，减少器官损伤；
避气泡：输液管排空防血栓；
✅成功标志：老鼠抽搐+后肢绷直+脑组织发白发硬。
小鼠的灌注液用量：生理盐水20-30ml，多聚甲醛20ml左右。
?【避坑Q&A】
❓没有灌注固定的大鼠脑组织能不能做切片和免疫组化？
→如果没有灌注固定，而是直接取材然后放固定液中，可以进行免疫组化染色，只是效果没有灌注固定的效果好。
❓固定2周才做石蜡切片，对免疫组化有无影响？
→固定时间过长蛋白多肽链都交联在一起了，抗原性就很弱了，很可能没有阳性结果。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。
❓为什么灌注过的脑组织不能做Western Blot/PCR？
→多聚甲醛让蛋白交联，影响WB实验时蛋白的解聚
PCR要提RNA，RNA易降解，要用新鲜组织（PCR数据不准）
Western blot实验中，要用去污剂使各种蛋白发生变性、解聚，并变成统一的线性肽链，从而能够用凝胶电泳进行分子量的梯度分离。多聚甲醛会影响蛋白的解聚，从而使其无法用凝胶分离。WB和免疫组化所使用抗体的抗原表位也不同，WB的抗体一般识别蛋白的一级结构，所以可能也无法识别甲醛处理的蛋白。
PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必须新鲜取组织，然后尽快超低温冷藏或者马上抽提，否则非常容易降解，灌注固定的组织，原则上是能够提出RNA和DNA的，但是会有较多的降解，一般不建议。
科研小tips?：
切片方向：冠状面定位准，矢状面适合全脑3D重建
快收藏备用，实验不迷路！?
#实验室日常 #科研 #实验技巧 #医学实验 #医学检验 #动物实验 #医学生笔记 #生物实验 #科研学习
为什么必须灌注？
①脑组织软易变形，灌注固定保形态；
②减少取脑损伤；
③冲净红细胞，避免染色干扰。
⭐操作步骤（大鼠版）：
1️⃣ 麻醉开胸：沿胸骨剪开胸腔，暴露心脏，左心室30-45°剪口插管至主动脉。与心尖呈30-45°夹角剪开左心室，将灌注针从左心室插入主动脉，固定针头，再剪开右心耳。
2️⃣ 冲血+固定：
生理盐水快速冲洗（100-150ml），
观察肝脏/爪子变白即血液排净✅；
4%多聚甲醛先快后慢灌注250ml(大鼠），
耗时约50min，
四肢抽搐&肝脏发白、内脏鼓起即成功。
3️⃣ 后固定：
取脑后浸4%多聚甲醛4℃冰箱12-24小时。
⚠️注意事项：
人工气胸：剪膈肌小口让肺萎缩，减少器官损伤；
避气泡：输液管排空防血栓；
✅成功标志：老鼠抽搐+后肢绷直+脑组织发白发硬。
小鼠的灌注液用量：生理盐水20-30ml，多聚甲醛20ml左右。
?【避坑Q&A】
❓没有灌注固定的大鼠脑组织能不能做切片和免疫组化？
→如果没有灌注固定，而是直接取材然后放固定液中，可以进行免疫组化染色，只是效果没有灌注固定的效果好。
❓固定2周才做石蜡切片，对免疫组化有无影响？
→固定时间过长蛋白多肽链都交联在一起了，抗原性就很弱了，很可能没有阳性结果。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。
❓为什么灌注过的脑组织不能做Western Blot/PCR？
→多聚甲醛让蛋白交联，影响WB实验时蛋白的解聚
PCR要提RNA，RNA易降解，要用新鲜组织（PCR数据不准）
Western blot实验中，要用去污剂使各种蛋白发生变性、解聚，并变成统一的线性肽链，从而能够用凝胶电泳进行分子量的梯度分离。多聚甲醛会影响蛋白的解聚，从而使其无法用凝胶分离。WB和免疫组化所使用抗体的抗原表位也不同，WB的抗体一般识别蛋白的一级结构，所以可能也无法识别甲醛处理的蛋白。
PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必须新鲜取组织，然后尽快超低温冷藏或者马上抽提，否则非常容易降解，灌注固定的组织，原则上是能够提出RNA和DNA的，但是会有较多的降解，一般不建议。
科研小tips?：
切片方向：冠状面定位准，矢状面适合全脑3D重建
快收藏备用，实验不迷路！?
#实验室日常 #科研 #实验技巧 #医学实验 #医学检验 #动物实验 #医学生笔记 #生物实验 #科研学习