一、实验原理
平板克隆形成实验通过将细胞分散为单细胞悬液接种培养，观察单个细胞增殖形成含50个以上细胞的克隆（大小0.3-1.0mm），以克隆形成率反映细胞的贴壁能力与增殖活力，是评估细胞增殖、药物敏感性等的核心技术。
二、实验材料
• 基础培养基（如1640、DMEM，按需选择）、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、青霉素-链霉素溶液。
• 固定液：4%多聚甲醛或1:3醋酸/甲醇混合液。
• 染色液：0.1%结晶紫染液或Giemsa染液。
• 实验器具：6孔板或培养皿、移液器、细胞计数板、CO₂培养箱。
三、操作步骤
1. 细胞制备与接种
◦ 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加含血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液（分散度需达95%以上，避免细胞团影响结果）。
◦ 细胞计数后，按梯度密度（如50、100、200个细胞/孔或每皿100个细胞）接种至含37℃预温培养基的6孔板或培养皿中，轻轻转动使细胞均匀分布（图1所示）。
2. 克隆培养
◦ 将接种好的细胞置于37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养2-3周，每隔3-5天更换一次培养基，换液时缓慢加液，避免吹起贴壁细胞（图2所示）。
◦ 定期观察，待肉眼可见克隆时终止培养。
3. 固定与染色
◦ 弃去上清液，用PBS小心浸洗2次，去除残留培养基。
◦ 每孔或每皿加入适量固定液（如1mL 4%多聚甲醛），室温固定15-60分钟，弃去固定液（图3所示）。
◦ 加入染色液（结晶紫或Giemsa），静置10-30分钟，回收染色液后用流水缓慢洗去残留染液，倒置晾干。
4. 结果统计
◦ 用数码相机拍摄整个培养孔/皿的克隆全貌，显微镜下拍摄单个克隆细节（图4所示）。
◦ 计数含50个细胞以上的克隆，按公式计算克隆形成率：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。
四、关键注意事项
• 细胞悬液制备和接种密度是实验成功关键：密度过高易导致克隆重叠，过低则克隆数量过少，需根据细胞增殖能力调整。
• 染色后务必洗净残留染液，否则背景杂乱影响计数；固定时间不可过长，避免细胞形态变形。
平板克隆形成实验通过将细胞分散为单细胞悬液接种培养，观察单个细胞增殖形成含50个以上细胞的克隆（大小0.3-1.0mm），以克隆形成率反映细胞的贴壁能力与增殖活力，是评估细胞增殖、药物敏感性等的核心技术。
二、实验材料
• 基础培养基（如1640、DMEM，按需选择）、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、青霉素-链霉素溶液。
• 固定液：4%多聚甲醛或1:3醋酸/甲醇混合液。
• 染色液：0.1%结晶紫染液或Giemsa染液。
• 实验器具：6孔板或培养皿、移液器、细胞计数板、CO₂培养箱。
三、操作步骤
1. 细胞制备与接种
◦ 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加含血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液（分散度需达95%以上，避免细胞团影响结果）。
◦ 细胞计数后，按梯度密度（如50、100、200个细胞/孔或每皿100个细胞）接种至含37℃预温培养基的6孔板或培养皿中，轻轻转动使细胞均匀分布（图1所示）。
2. 克隆培养
◦ 将接种好的细胞置于37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养2-3周，每隔3-5天更换一次培养基，换液时缓慢加液，避免吹起贴壁细胞（图2所示）。
◦ 定期观察，待肉眼可见克隆时终止培养。
3. 固定与染色
◦ 弃去上清液，用PBS小心浸洗2次，去除残留培养基。
◦ 每孔或每皿加入适量固定液（如1mL 4%多聚甲醛），室温固定15-60分钟，弃去固定液（图3所示）。
◦ 加入染色液（结晶紫或Giemsa），静置10-30分钟，回收染色液后用流水缓慢洗去残留染液，倒置晾干。
4. 结果统计
◦ 用数码相机拍摄整个培养孔/皿的克隆全貌，显微镜下拍摄单个克隆细节（图4所示）。
◦ 计数含50个细胞以上的克隆，按公式计算克隆形成率：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。
四、关键注意事项
• 细胞悬液制备和接种密度是实验成功关键：密度过高易导致克隆重叠，过低则克隆数量过少，需根据细胞增殖能力调整。
• 染色后务必洗净残留染液，否则背景杂乱影响计数；固定时间不可过长，避免细胞形态变形。