方法参考自最后一张图片的文献
一、肺气道芯片的构建
微流控双通道器官芯片，包含两个相邻的平行微通道，由多孔膜隔开。
70%乙醇清洗，加入ER1溶液充满通道，紫外灯下放置20min。
ER2缓冲液、PBS依次清洗通道。
将多孔膜的两侧用人胎盘来源的IV型胶原蛋白在室温下包被过夜。
从芯片中吸出溶液，随后用于接种细胞。
原代人肺支气管气道上皮基底干细胞，组织培养瓶中扩增至60-70%汇合。
原代人肺微血管内皮细胞在组织培养瓶中扩增至70-80%汇合。
芯片倒置，将内皮细胞（2 × 10⁷ 细胞/mL）接种到底部通道，持续4h。
翻转芯片，将肺支气管气道上皮基底干细胞（2.5 × 10⁶ 细胞/mL）接种到顶部通道，持续4h。
更换各自通道的培养基，芯片在37°C、5% CO₂条件下静态培养过夜。
以60 µL/h的体积流速，用各自的细胞培养基持续灌注粘附的细胞。
5-7天后，移除顶端培养基，让空气充满该通道以建立气液界面（ALI），并且仅通过基底血管通道持续流动的PneumaCult-ALI培养基补充0.1% VEGF、0.01% EGF和1mM CaCl₂来培养气道上皮细胞，持续培养3-4周。
芯片在含有5% CO₂和16-18% O₂、湿度为85-95%的培养箱中培养
并且每周用PBS冲洗上皮顶端表面一次以去除细胞碎片和粘液。
高度分化的人体气道结构和功能可以在人体气道芯片中维持超过2个月。
二、免疫荧光
固定：顶端和基底通道用PBS清洗，4%多聚甲醛固定20-25min，PBS清洗，4°C保存
固定后在芯片上用含0.1% Triton X-100的PBS溶液透化5min，室温下用含10%山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS溶液封闭30min，随后与一抗在4°C下孵育过夜（一抗使用含1%山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS作为孵育缓冲液稀释），再与相应的二抗室温孵育1h；DAPI核染。
三、屏障通透性检测
底部通道加入50 μL含Cascade蓝的细胞培养基，顶部通道则加入50 μl普通培养基。2h后，检测3个不同人体气道芯片的上下通道培养基荧光强度。Papp = J/(A × ΔC)计算表观渗透率。
四、粘液定量
芯片的上层通道注入50μLPBS，37°C孵育1h，阿尔新蓝染色法定量粘液产量，并与PBS中粘蛋白的系列稀释标准品进行比较。
#类器官 #生命科学 #器官芯片
一、肺气道芯片的构建
微流控双通道器官芯片，包含两个相邻的平行微通道，由多孔膜隔开。
70%乙醇清洗，加入ER1溶液充满通道，紫外灯下放置20min。
ER2缓冲液、PBS依次清洗通道。
将多孔膜的两侧用人胎盘来源的IV型胶原蛋白在室温下包被过夜。
从芯片中吸出溶液，随后用于接种细胞。
原代人肺支气管气道上皮基底干细胞，组织培养瓶中扩增至60-70%汇合。
原代人肺微血管内皮细胞在组织培养瓶中扩增至70-80%汇合。
芯片倒置，将内皮细胞（2 × 10⁷ 细胞/mL）接种到底部通道，持续4h。
翻转芯片，将肺支气管气道上皮基底干细胞（2.5 × 10⁶ 细胞/mL）接种到顶部通道，持续4h。
更换各自通道的培养基，芯片在37°C、5% CO₂条件下静态培养过夜。
以60 µL/h的体积流速，用各自的细胞培养基持续灌注粘附的细胞。
5-7天后，移除顶端培养基，让空气充满该通道以建立气液界面（ALI），并且仅通过基底血管通道持续流动的PneumaCult-ALI培养基补充0.1% VEGF、0.01% EGF和1mM CaCl₂来培养气道上皮细胞，持续培养3-4周。
芯片在含有5% CO₂和16-18% O₂、湿度为85-95%的培养箱中培养
并且每周用PBS冲洗上皮顶端表面一次以去除细胞碎片和粘液。
高度分化的人体气道结构和功能可以在人体气道芯片中维持超过2个月。
二、免疫荧光
固定：顶端和基底通道用PBS清洗，4%多聚甲醛固定20-25min，PBS清洗，4°C保存
固定后在芯片上用含0.1% Triton X-100的PBS溶液透化5min，室温下用含10%山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS溶液封闭30min，随后与一抗在4°C下孵育过夜（一抗使用含1%山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS作为孵育缓冲液稀释），再与相应的二抗室温孵育1h；DAPI核染。
三、屏障通透性检测
底部通道加入50 μL含Cascade蓝的细胞培养基，顶部通道则加入50 μl普通培养基。2h后，检测3个不同人体气道芯片的上下通道培养基荧光强度。Papp = J/(A × ΔC)计算表观渗透率。
四、粘液定量
芯片的上层通道注入50μLPBS，37°C孵育1h，阿尔新蓝染色法定量粘液产量，并与PBS中粘蛋白的系列稀释标准品进行比较。
#类器官 #生命科学 #器官芯片