免疫荧光是否需要爬片？
具体是直接铺板/还是爬片，看实验室后续扫描设备，如果能直接扫描或拍照培养板就细胞板或者共聚焦培养皿中铺细胞；
如果只能切片扫描就采用细胞爬片。
——————实验步骤?✨?
day1️⃣
1、准备细胞爬片?
在24孔板中放入爬片，每孔3万个cell ⚠️不要太多，处理48h（根据个人药物时间而定）
day2️⃣
2、如果需要染活细胞（比如线粒体），则需要在细胞处理结束时，用 mitotractor染色37°C培养 20~40 min（不需要染活细胞忽略此步）
3、弃上清，PBS洗一遍；
4、固定：4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗三次；
5、通透：用3%Trition-100,4°C，通透10 min；洗（同上）；
6、 封闭：5%的BSA 室温封闭1 h
7、 一抗孵育：4°C过夜
day3️⃣ 拿出细胞板 恢复室温
8、PBS洗3遍
孵育二抗：室温 1~2h；PBS洗；
9、DAPI 染色10 min
10、封片：先把抗荧光衰灭封片剂滴在载玻片上用镊子针头将爬片抠出来倒扣在载玻片上
11、荧光显微镜观察拍照?
——————注意事项⚠️⚠️⚠️
✅如何有效避免串色？
避免细胞太密，会导致一抗结合蛋白增多，容易出现非特异性染色，且太密拍摄效果很一般
一般6孔板长满的话，取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。
✅细胞核染色放在最后‼️
不要最开始染核，放到最后封片时，用DAPI 染，DAPI浓度不要过高，染色时间根据师兄师姐的经验确定一般5min左右
✅一抗染色：浓度可以适当提高，根据说明书
4度过夜染效果更好
✅二抗染色：常温孵育1～2h，避光，避开同属性的二抗，洗一抗可用pbs，二抗可以用tbst，多加一些吐温
✅保持孵育环境湿润，不要让抗体干了，不然都是非特异染色
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具体是直接铺板/还是爬片，看实验室后续扫描设备，如果能直接扫描或拍照培养板就细胞板或者共聚焦培养皿中铺细胞；
如果只能切片扫描就采用细胞爬片。
——————实验步骤?✨?
day1️⃣
1、准备细胞爬片?
在24孔板中放入爬片，每孔3万个cell ⚠️不要太多，处理48h（根据个人药物时间而定）
day2️⃣
2、如果需要染活细胞（比如线粒体），则需要在细胞处理结束时，用 mitotractor染色37°C培养 20~40 min（不需要染活细胞忽略此步）
3、弃上清，PBS洗一遍；
4、固定：4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗三次；
5、通透：用3%Trition-100,4°C，通透10 min；洗（同上）；
6、 封闭：5%的BSA 室温封闭1 h
7、 一抗孵育：4°C过夜
day3️⃣ 拿出细胞板 恢复室温
8、PBS洗3遍
孵育二抗：室温 1~2h；PBS洗；
9、DAPI 染色10 min
10、封片：先把抗荧光衰灭封片剂滴在载玻片上用镊子针头将爬片抠出来倒扣在载玻片上
11、荧光显微镜观察拍照?
——————注意事项⚠️⚠️⚠️
✅如何有效避免串色？
避免细胞太密，会导致一抗结合蛋白增多，容易出现非特异性染色，且太密拍摄效果很一般
一般6孔板长满的话，取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。
✅细胞核染色放在最后‼️
不要最开始染核，放到最后封片时，用DAPI 染，DAPI浓度不要过高，染色时间根据师兄师姐的经验确定一般5min左右
✅一抗染色：浓度可以适当提高，根据说明书
4度过夜染效果更好
✅二抗染色：常温孵育1～2h，避光，避开同属性的二抗，洗一抗可用pbs，二抗可以用tbst，多加一些吐温
✅保持孵育环境湿润，不要让抗体干了，不然都是非特异染色
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