实验原理
用标记的抗体对组织/细胞中相应抗原进行定位、定性或定量分析
1.样品准备: 提前12-24h在24孔板放置爬片(提前泡酒精或高压灭菌)或用共聚焦小皿，铺细胞使第二天细胞密度为50-60%(细胞密度视情况而定)
2.固定 (锁定细胞化学和蛋白状态)
从培养箱取出细胞板，弃旧培养基，加入PBS洗3遍(润洗即可，无需摇床);加入4%多聚甲醛(能盖住细胞的量即可)，室温固定15min，PBS洗3遍
3.透化(使抗体和染料进入胞内)
0.1%Triton X-100室温通透10-20min(时间根据蛋白定位调整，胞质蛋白5-10min即可，核蛋白20min)
注:此步骤针对细胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略
4.封闭 (减少抗体的非特异性结合):加入封闭液(3-5%BSA，PBS配制)，室温封闭30-60min
5.一抗:根据抗体说明书配制一抗(封闭液稀释)，吸弃封闭液，不洗，每孔加入50-100μL抗体，在抗体周围孔内加水(保湿)，用封口膜缠绕孔板，4℃摇床孵育过夜或室温摇床1-2h
6.二抗:回收一抗，PBS洗3遍，每次5min(上摇床)，每孔加入50-100μL二抗，室温避光孵育 1h
注:此步骤及后续均需避光，可用锡纸包裹孔板
7.DAPI 染核及封片:弃二抗，PBS洗3遍(5min/次)，在载玻片上滴加20μL含 DAPI 的封片剂，将细胞爬片倒扣在封片剂上
#科研 #科研 #细胞实验#实验设计#科研学习 #实验室日常
用标记的抗体对组织/细胞中相应抗原进行定位、定性或定量分析
1.样品准备: 提前12-24h在24孔板放置爬片(提前泡酒精或高压灭菌)或用共聚焦小皿，铺细胞使第二天细胞密度为50-60%(细胞密度视情况而定)
2.固定 (锁定细胞化学和蛋白状态)
从培养箱取出细胞板，弃旧培养基，加入PBS洗3遍(润洗即可，无需摇床);加入4%多聚甲醛(能盖住细胞的量即可)，室温固定15min，PBS洗3遍
3.透化(使抗体和染料进入胞内)
0.1%Triton X-100室温通透10-20min(时间根据蛋白定位调整，胞质蛋白5-10min即可，核蛋白20min)
注:此步骤针对细胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略
4.封闭 (减少抗体的非特异性结合):加入封闭液(3-5%BSA，PBS配制)，室温封闭30-60min
5.一抗:根据抗体说明书配制一抗(封闭液稀释)，吸弃封闭液，不洗，每孔加入50-100μL抗体，在抗体周围孔内加水(保湿)，用封口膜缠绕孔板，4℃摇床孵育过夜或室温摇床1-2h
6.二抗:回收一抗，PBS洗3遍，每次5min(上摇床)，每孔加入50-100μL二抗，室温避光孵育 1h
注:此步骤及后续均需避光，可用锡纸包裹孔板
7.DAPI 染核及封片:弃二抗，PBS洗3遍(5min/次)，在载玻片上滴加20μL含 DAPI 的封片剂，将细胞爬片倒扣在封片剂上
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