TRAP染色（酒石酸抵抗性酸性磷酸酶染色）主要用于检测破骨细胞等细胞中的酸性磷酸酶活性，核心是通过特异性底物显色，区分酒石酸抵抗性的酸性磷酸酶（破骨细胞特征性酶）与普通酸性磷酸酶。以下是常规细胞爬片/组织切片的TRAP染色实验流程（以常用的偶氮偶联法为例）：
一、实验前准备?
1. 样本处理
- 若为细胞爬片：将贴壁生长的细胞（如破骨细胞）用PBS清洗2次，去除培养基残留，然后用4%多聚甲醛室温固定15-20分钟，固定后再用PBS清洗3次（每次3分钟），吸干残留液体。
- 若为组织切片：将脱蜡至水的石蜡切片（或冷冻切片）用PBS清洗2次，每次3分钟，备用。
2. 试剂准备：提前配制TRAP染色工作液。
二、核心染色步骤?
1. 孵育工作液：将配制好的TRAP染色工作液均匀覆盖在样本表面（细胞爬片/切片），置于湿盒中室温孵育30-60分钟（具体时间需根据试剂盒说明或预实验调整，以显色清晰、背景低为宜）。
2. 终止反应：孵育结束后，用蒸馏水轻轻冲洗样本3次，每次2分钟，彻底去除残留的工作液，终止染色反应。
3. 复染（可选）：若需区分细胞核，可将样本浸入苏木素染液中复染1-2分钟，然后用蒸馏水冲洗，再用1%盐酸酒精分化数秒，最后用自来水返蓝5分钟。
4. 脱水透明（仅组织切片）：复染后的切片依次用70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水（每次3分钟），再用二甲苯透明2次（每次5分钟）。
5. 封片：细胞爬片或透明后的切片滴加中性树胶或封片剂，加盖盖玻片，避免产生气泡，室温晾干后即可观察。
三、结果判读?
- 阳性信号：破骨细胞的胞质中出现红色或紫红色颗粒/斑块（TRAP酶活性部位），且该染色能抵抗酒石酸的抑制。
- 阴性对照：普通成纤维细胞、成骨细胞等胞质无明显显色，或仅呈极浅的背景色。
四、关键注意事项?
1. 试剂时效性：TRAP染色工作液需现配现用，底物（如萘酚AS-BI磷酸钠）易失效，避免长时间放置。
2. 酒石酸的作用：工作液中必须加入酒石酸钾钠，以抑制非特异性酸性磷酸酶活性，确保染色仅针对破骨细胞特异性的TRAP。
3. 孵育条件：温度和时间需严格控制，孵育过久会导致背景染色加深，过短则阳性信号弱。
4. 样本固定：固定时间不宜过长（不超过20分钟），否则会破坏酶活性，导致染色失败。
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一、实验前准备?
1. 样本处理
- 若为细胞爬片：将贴壁生长的细胞（如破骨细胞）用PBS清洗2次，去除培养基残留，然后用4%多聚甲醛室温固定15-20分钟，固定后再用PBS清洗3次（每次3分钟），吸干残留液体。
- 若为组织切片：将脱蜡至水的石蜡切片（或冷冻切片）用PBS清洗2次，每次3分钟，备用。
2. 试剂准备：提前配制TRAP染色工作液。
二、核心染色步骤?
1. 孵育工作液：将配制好的TRAP染色工作液均匀覆盖在样本表面（细胞爬片/切片），置于湿盒中室温孵育30-60分钟（具体时间需根据试剂盒说明或预实验调整，以显色清晰、背景低为宜）。
2. 终止反应：孵育结束后，用蒸馏水轻轻冲洗样本3次，每次2分钟，彻底去除残留的工作液，终止染色反应。
3. 复染（可选）：若需区分细胞核，可将样本浸入苏木素染液中复染1-2分钟，然后用蒸馏水冲洗，再用1%盐酸酒精分化数秒，最后用自来水返蓝5分钟。
4. 脱水透明（仅组织切片）：复染后的切片依次用70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水（每次3分钟），再用二甲苯透明2次（每次5分钟）。
5. 封片：细胞爬片或透明后的切片滴加中性树胶或封片剂，加盖盖玻片，避免产生气泡，室温晾干后即可观察。
三、结果判读?
- 阳性信号：破骨细胞的胞质中出现红色或紫红色颗粒/斑块（TRAP酶活性部位），且该染色能抵抗酒石酸的抑制。
- 阴性对照：普通成纤维细胞、成骨细胞等胞质无明显显色，或仅呈极浅的背景色。
四、关键注意事项?
1. 试剂时效性：TRAP染色工作液需现配现用，底物（如萘酚AS-BI磷酸钠）易失效，避免长时间放置。
2. 酒石酸的作用：工作液中必须加入酒石酸钾钠，以抑制非特异性酸性磷酸酶活性，确保染色仅针对破骨细胞特异性的TRAP。
3. 孵育条件：温度和时间需严格控制，孵育过久会导致背景染色加深，过短则阳性信号弱。
4. 样本固定：固定时间不宜过长（不超过20分钟），否则会破坏酶活性，导致染色失败。
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