原位杂交（FISH）是通过标记的核酸探针与组织或细胞内的靶核酸（DNA或RNA）互补结合，在原位检测其位置和表达的技术，流程如下：
一、实验前准备
1. ?样本处理：
-组织样本：新鲜组织经甲醛固定、石蜡包埋（石蜡切片），或冷冻切片（需-80℃保存）。
- 细胞样本：爬片细胞经4%多聚甲醛固定15-20分钟，PBS洗涤。
2. ?探针准备：根据靶序列设计互补探针，标记方式包括地高辛、生物素、荧光素等（荧光标记用于荧光原位杂交FISH）。
二、实验流程（以石蜡切片RNA原位杂交为例）
1. 样本预处理
?脱蜡复水：石蜡切片依次经二甲苯（脱蜡，2次，各10分钟）、梯度乙醇（100%、95%、80%、70%，各5分钟），最后用DEPC水洗涤，去除石蜡并复水。
?抗原修复（可选）：对于RNA检测，可省略；若为DNA检测或需暴露靶序列，可用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）高温修复10-15分钟，冷却后PBS洗涤。
?蛋白酶处理：加入蛋白酶K（20-30μg/mL，用TE缓冲液稀释），37℃孵育10-30分钟（根据组织类型调整，目的是通透细胞膜，便于探针进入），DEPC水终止反应。
2. 预杂交与杂交
?预杂交：加入预杂交液（含鲑鱼精DNA、牛血清白蛋白等，封闭非特异性结合位点），37-50℃孵育1-2小时，去除预杂交液（不洗涤）。
?探针杂交：将标记的探针用杂交液稀释（浓度通常0.5-5μg/mL），滴加于样本上，加盖盖玻片，42-55℃（根据探针Tm值调整）湿盒内杂交过夜（12-16小时）。
3. 洗涤去除未结合探针?
杂交后，依次用低严格度洗涤液（如2×SSC，37℃，15分钟）和高严格度洗涤液（如0.1×SSC，50-65℃，15分钟×2次），洗去未特异性结合的探针，降低背景。
4. 信号检测（以地高辛标记探针为例）
?封闭：加入含1-5%封闭血清的缓冲液，室温孵育30分钟，封闭非特异性结合。
?抗体孵育：滴加抗地高辛抗体（如碱性磷酸酶偶联抗体），37℃孵育1-2小时，PBS洗涤3次，每次5分钟。
?显色反应：加入显色底物（如NBT/BCIP），室温避光孵育，直至信号清晰（通常30分钟-数小时，镜下观察控制），用TE缓冲液终止反应。
5. 复染与封片
?用苏木素轻度复染细胞核（1-3分钟），流水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。
?中性树胶封片，光学显微镜下观察（杂交信号为蓝紫色，细胞核为蓝色）。
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一、实验前准备
1. ?样本处理：
-组织样本：新鲜组织经甲醛固定、石蜡包埋（石蜡切片），或冷冻切片（需-80℃保存）。
- 细胞样本：爬片细胞经4%多聚甲醛固定15-20分钟，PBS洗涤。
2. ?探针准备：根据靶序列设计互补探针，标记方式包括地高辛、生物素、荧光素等（荧光标记用于荧光原位杂交FISH）。
二、实验流程（以石蜡切片RNA原位杂交为例）
1. 样本预处理
?脱蜡复水：石蜡切片依次经二甲苯（脱蜡，2次，各10分钟）、梯度乙醇（100%、95%、80%、70%，各5分钟），最后用DEPC水洗涤，去除石蜡并复水。
?抗原修复（可选）：对于RNA检测，可省略；若为DNA检测或需暴露靶序列，可用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）高温修复10-15分钟，冷却后PBS洗涤。
?蛋白酶处理：加入蛋白酶K（20-30μg/mL，用TE缓冲液稀释），37℃孵育10-30分钟（根据组织类型调整，目的是通透细胞膜，便于探针进入），DEPC水终止反应。
2. 预杂交与杂交
?预杂交：加入预杂交液（含鲑鱼精DNA、牛血清白蛋白等，封闭非特异性结合位点），37-50℃孵育1-2小时，去除预杂交液（不洗涤）。
?探针杂交：将标记的探针用杂交液稀释（浓度通常0.5-5μg/mL），滴加于样本上，加盖盖玻片，42-55℃（根据探针Tm值调整）湿盒内杂交过夜（12-16小时）。
3. 洗涤去除未结合探针?
杂交后，依次用低严格度洗涤液（如2×SSC，37℃，15分钟）和高严格度洗涤液（如0.1×SSC，50-65℃，15分钟×2次），洗去未特异性结合的探针，降低背景。
4. 信号检测（以地高辛标记探针为例）
?封闭：加入含1-5%封闭血清的缓冲液，室温孵育30分钟，封闭非特异性结合。
?抗体孵育：滴加抗地高辛抗体（如碱性磷酸酶偶联抗体），37℃孵育1-2小时，PBS洗涤3次，每次5分钟。
?显色反应：加入显色底物（如NBT/BCIP），室温避光孵育，直至信号清晰（通常30分钟-数小时，镜下观察控制），用TE缓冲液终止反应。
5. 复染与封片
?用苏木素轻度复染细胞核（1-3分钟），流水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。
?中性树胶封片，光学显微镜下观察（杂交信号为蓝紫色，细胞核为蓝色）。
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