免疫荧光成像的实用技巧
抗体选择
一抗是染色中最重要的部分，确保您的抗体与正确的配体结合非常关键。可以查看厂商提供的抗体数据表，仔细观察抗体的染色图像，确保抗体能够与细胞特异性结合。其次，可查询使用相关抗体发表的文献，以验证抗体的染色是否具有特异性。此外，还可通过人类蛋白质图谱查看蛋白质通常在哪些细胞类型中表达，并与想要染色的蛋白质进行匹配，以确保抗体染色的可行性且排除非特异性信号。当对组织或细胞进行染色时，可以结合不同物种来源的抗体来突出不同的细胞结构。
样本固定
组织固定是获得良好免疫荧光图像的最关键步骤之一。在4°C下，将组织（胃、肠、结肠、肝脏）在4%多聚甲醛溶液（PFA）或10%中性缓冲福尔马林中固定18小时。请确保在固定之前对组织进行定向或精细切片。对于胃和肠道组织，可使用Whatman™滤纸将组织平铺并展开，然后将组织固定在Whatman™滤纸上。
抗体稀释倍数和细胞密度
对于新抗体，通常从低稀释度开始稀释。1:100的稀释比例一般具有较好的效果，但也可根据需要增加或减少稀释度。如果无法从抗体获得信号，可尝试使用不同的固定剂（如乙二醛），更改抗原修复缓冲液，或者使用冷冻切片替代FFPE切片。
实时成像染色
在添加染料之前和之后彻底清洗样本非常重要，否则会导致背景噪点极大且难以正确聚焦。另外需要注意的是细胞对染料的耐受性有一个时间限制，并且某些染料（例如Hoechst33342）会在几小时后导致细胞死亡。
抗体选择
一抗是染色中最重要的部分，确保您的抗体与正确的配体结合非常关键。可以查看厂商提供的抗体数据表，仔细观察抗体的染色图像，确保抗体能够与细胞特异性结合。其次，可查询使用相关抗体发表的文献，以验证抗体的染色是否具有特异性。此外，还可通过人类蛋白质图谱查看蛋白质通常在哪些细胞类型中表达，并与想要染色的蛋白质进行匹配，以确保抗体染色的可行性且排除非特异性信号。当对组织或细胞进行染色时，可以结合不同物种来源的抗体来突出不同的细胞结构。
样本固定
组织固定是获得良好免疫荧光图像的最关键步骤之一。在4°C下，将组织（胃、肠、结肠、肝脏）在4%多聚甲醛溶液（PFA）或10%中性缓冲福尔马林中固定18小时。请确保在固定之前对组织进行定向或精细切片。对于胃和肠道组织，可使用Whatman™滤纸将组织平铺并展开，然后将组织固定在Whatman™滤纸上。
抗体稀释倍数和细胞密度
对于新抗体，通常从低稀释度开始稀释。1:100的稀释比例一般具有较好的效果，但也可根据需要增加或减少稀释度。如果无法从抗体获得信号，可尝试使用不同的固定剂（如乙二醛），更改抗原修复缓冲液，或者使用冷冻切片替代FFPE切片。
实时成像染色
在添加染料之前和之后彻底清洗样本非常重要，否则会导致背景噪点极大且难以正确聚焦。另外需要注意的是细胞对染料的耐受性有一个时间限制，并且某些染料（例如Hoechst33342）会在几小时后导致细胞死亡。