1.实验准备：
提前培养人永生化口腔上皮细胞（如HOK细胞），使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养至对数生长期；同时将白色念珠菌标准株（如SC5314）接种于YPD培养基，30℃摇床培养16-18h，收集菌液后用PBS洗涤3次，调整菌浓度至1×10⁶CFU/mL备用。
2.细胞铺板：
将对数生长期的口腔上皮细胞消化后计数，以2×10⁵个/孔的密度接种于24孔细胞培养板，每孔加入1mL完全培养基，继续培养24h，待细胞融合度达到80%-90%时进行后续感染实验。
3.念珠菌感染：
吸弃培养板中的旧培养基，用无菌PBS轻柔洗涤细胞2次；按 multiplicity of infection（MOI）=10:1 的比例（即念珠菌与细胞数量比），向每孔加入1mL调整好浓度的念珠菌悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中共同孵育2h（可根据实验需求调整孵育时间，如0.5h、1h、4h）。
4.感染后处理：
孵育结束后，吸弃孔内的念珠菌悬液，用PBS反复洗涤细胞3次，去除未黏附、未入侵的游离念珠菌；若需检测细胞损伤或炎症因子，可加入新鲜无血清培养基继续培养，收集不同时间点的上清液；若需观察细胞内念珠菌，可直接进行固定染色。
5.检测与分析：
- 细胞形态观察：用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤后，通过吉姆萨染色或荧光染色（如 Calcofluor White 染色念珠菌细胞壁），在光学显微镜或荧光显微镜下观察细胞形态变化及念珠菌在细胞内的分布。
- 细胞活力检测：采用MTT法或CCK-8法，向处理后的细胞孔中加入检测试剂，孵育后用酶标仪测定450nm处吸光度值，计算细胞存活率，评估念珠菌对细胞的毒性。
- 念珠菌入侵计数：将固定后的细胞用0.1% Triton X-100通透处理，再经荧光染色，随机选取5个视野，计数每个视野内入侵上皮细胞的念珠菌数量，统计平均入侵率。
- 炎症因子检测：收集培养上清液，通过ELISA法检测IL-6、IL-8等炎症因子的表达水平，或用RT-PCR检测细胞内炎症因子mRNA的相对表达量，分析感染引发的炎症反应。
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提前培养人永生化口腔上皮细胞（如HOK细胞），使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养至对数生长期；同时将白色念珠菌标准株（如SC5314）接种于YPD培养基，30℃摇床培养16-18h，收集菌液后用PBS洗涤3次，调整菌浓度至1×10⁶CFU/mL备用。
2.细胞铺板：
将对数生长期的口腔上皮细胞消化后计数，以2×10⁵个/孔的密度接种于24孔细胞培养板，每孔加入1mL完全培养基，继续培养24h，待细胞融合度达到80%-90%时进行后续感染实验。
3.念珠菌感染：
吸弃培养板中的旧培养基，用无菌PBS轻柔洗涤细胞2次；按 multiplicity of infection（MOI）=10:1 的比例（即念珠菌与细胞数量比），向每孔加入1mL调整好浓度的念珠菌悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中共同孵育2h（可根据实验需求调整孵育时间，如0.5h、1h、4h）。
4.感染后处理：
孵育结束后，吸弃孔内的念珠菌悬液，用PBS反复洗涤细胞3次，去除未黏附、未入侵的游离念珠菌；若需检测细胞损伤或炎症因子，可加入新鲜无血清培养基继续培养，收集不同时间点的上清液；若需观察细胞内念珠菌，可直接进行固定染色。
5.检测与分析：
- 细胞形态观察：用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤后，通过吉姆萨染色或荧光染色（如 Calcofluor White 染色念珠菌细胞壁），在光学显微镜或荧光显微镜下观察细胞形态变化及念珠菌在细胞内的分布。
- 细胞活力检测：采用MTT法或CCK-8法，向处理后的细胞孔中加入检测试剂，孵育后用酶标仪测定450nm处吸光度值，计算细胞存活率，评估念珠菌对细胞的毒性。
- 念珠菌入侵计数：将固定后的细胞用0.1% Triton X-100通透处理，再经荧光染色，随机选取5个视野，计数每个视野内入侵上皮细胞的念珠菌数量，统计平均入侵率。
- 炎症因子检测：收集培养上清液，通过ELISA法检测IL-6、IL-8等炎症因子的表达水平，或用RT-PCR检测细胞内炎症因子mRNA的相对表达量，分析感染引发的炎症反应。
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