一、实验准备
1、材料?
对数生长期的细胞株、细胞培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、6孔细胞培养板、移液器、离心管、培养皿、细胞计数板、显微镜。
2、试剂配制?
提前将培养基、胰蛋白酶置于37℃水浴锅预热，保证操作时温度适宜细胞。
3、器具准备?
将6孔板、移液器枪头、离心管等放入高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟，烘干备用。
二、细胞消化与计数?
1、从培养箱取出长满细胞的培养瓶，在超净工作台中，吸去旧培养基。
2、加入3-5 mL PBS轻轻冲洗细胞2次，去除残留培养基。
3、向培养瓶中加入1-2 mL 0.25%胰蛋白酶，置于37℃培养箱消化1-2分钟，显微镜下观察，待细胞变圆且大部分脱离瓶壁时，立即加入等体积含血清培养基终止消化。
4、用移液器轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm离心5分钟。
5、弃上清，加入适量培养基重悬细胞，用移液器吹打均匀。取少量细胞悬液滴于细胞计数板，在显微镜下计数，计算细胞密度。
三、铺板?
1、根据细胞生长特性和实验目的，用培养基将细胞稀释至合适浓度，如100-500个/mL。
2、在超净工作台中，向6孔板每孔加入2 mL稀释好的细胞悬液，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。
3、将6孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养10-14天，期间每隔2-3天更换一次培养基，观察细胞克隆形成情况。
四、固定与染色?
1、待细胞克隆肉眼可见时，从培养箱取出6孔板，吸去培养基。
2、每孔加入3-5 mL PBS轻轻冲洗细胞2次，去除残留培养基。
3、每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定15-20分钟。
4、弃去多聚甲醛，用PBS冲洗2-3次，每次3-5分钟。
5、每孔加入1 mL结晶紫染液，室温染色10-15分钟。
6、用流水缓慢冲洗6孔板，直至背景无色，将6孔板倒置晾干。
五、结果分析?
1、在显微镜下观察，以含有50个细胞以上的细胞团计为一个克隆。
2、用棉签小心擦去无克隆生长区域的染色，保留克隆。
3、将6孔板置于扫描仪上扫描，使用图像分析软件计数克隆数。
4、计算克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%，分析不同处理组细胞克隆形成能力差异。
#实验 #医学实验 #科研 #检测 #科研学习 #细胞 #科研人的精神状态 #检测 #生物医学科研 #细胞实验
1、材料?
对数生长期的细胞株、细胞培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、6孔细胞培养板、移液器、离心管、培养皿、细胞计数板、显微镜。
2、试剂配制?
提前将培养基、胰蛋白酶置于37℃水浴锅预热，保证操作时温度适宜细胞。
3、器具准备?
将6孔板、移液器枪头、离心管等放入高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟，烘干备用。
二、细胞消化与计数?
1、从培养箱取出长满细胞的培养瓶，在超净工作台中，吸去旧培养基。
2、加入3-5 mL PBS轻轻冲洗细胞2次，去除残留培养基。
3、向培养瓶中加入1-2 mL 0.25%胰蛋白酶，置于37℃培养箱消化1-2分钟，显微镜下观察，待细胞变圆且大部分脱离瓶壁时，立即加入等体积含血清培养基终止消化。
4、用移液器轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm离心5分钟。
5、弃上清，加入适量培养基重悬细胞，用移液器吹打均匀。取少量细胞悬液滴于细胞计数板，在显微镜下计数，计算细胞密度。
三、铺板?
1、根据细胞生长特性和实验目的，用培养基将细胞稀释至合适浓度，如100-500个/mL。
2、在超净工作台中，向6孔板每孔加入2 mL稀释好的细胞悬液，轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。
3、将6孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养10-14天，期间每隔2-3天更换一次培养基，观察细胞克隆形成情况。
四、固定与染色?
1、待细胞克隆肉眼可见时，从培养箱取出6孔板，吸去培养基。
2、每孔加入3-5 mL PBS轻轻冲洗细胞2次，去除残留培养基。
3、每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定15-20分钟。
4、弃去多聚甲醛，用PBS冲洗2-3次，每次3-5分钟。
5、每孔加入1 mL结晶紫染液，室温染色10-15分钟。
6、用流水缓慢冲洗6孔板，直至背景无色，将6孔板倒置晾干。
五、结果分析?
1、在显微镜下观察，以含有50个细胞以上的细胞团计为一个克隆。
2、用棉签小心擦去无克隆生长区域的染色，保留克隆。
3、将6孔板置于扫描仪上扫描，使用图像分析软件计数克隆数。
4、计算克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%，分析不同处理组细胞克隆形成能力差异。
#实验 #医学实验 #科研 #检测 #科研学习 #细胞 #科研人的精神状态 #检测 #生物医学科研 #细胞实验