一、细胞准备
1. 找状态好的细胞，倒掉旧培养基，加消化液让细胞脱落，轻轻吹打成单细胞悬液。
2. 把圆形爬片放进24孔板里（每个孔放一片）
3. 根据细胞生长快慢，取适量细胞悬液加到有爬片的孔里，放进37℃培养箱让细胞贴壁生长
二、固定细胞
1. 倒掉培养基，用PBS洗细胞3次（每次轻轻晃一晃，洗掉残留培养基）
2. 每孔加1mL的4%多聚甲醛，室温固定10-20分钟（让细胞“定格”，防止蛋白跑掉）倒掉多聚甲醛。
3. 再用PBS洗2次，每次5分钟（洗去多聚甲醛残留）
三、通透处理
1. 每孔加1mL的0.5% Triton-X100（让细胞膜“变通透”，方便抗体进去），室温放10分钟，倒掉
2. 用PBS洗2次，每次5分钟（洗掉Triton-X100，避免影响后续抗体结合）
四、封闭杂信号
每孔加1mL的3% BSA封闭液（用牛血清蛋白堵住细胞表面非特异性结合位点），室温放1小时，倒掉
五、一抗孵育（关键！）
1. 把一抗按说明书稀释好，滴在爬片上（别滴太多，能盖住细胞就行）用锡箔纸包住孔板避光，放4℃冰箱过夜（让抗体和目标蛋白“一对一结合”）
2. 第二天用PBS洗5次，每次5分钟（洗去未结合的一抗，减少背景杂色）
六、二抗孵育（显色关键）
1. 用封闭液稀释二抗（二抗能“抓住”一抗，自带荧光标签）室温避光孵育1小时（别让荧光二抗见光，会失效）
2. 用PBS洗5次，每次5分钟（彻底洗掉未结合的二抗，避免荧光干扰）
七、DAPI染细胞核
1. 按1:4000稀释DAPI（蓝色荧光染核，按试剂盒说明来）每孔加1mL，避光染10分钟（别太久，核会太亮）
2. 用PBS洗3次，每次5分钟（洗掉多余DAPI，防止非特异性染色）
八、封片和拍照
1. 用镊子小心夹出爬片，用吸水纸吸掉多余液体（别碰到细胞！）在载玻片上滴5μL抗荧光淬灭剂（防止荧光“褪色”）
2. 把爬片细胞面朝下盖在液滴上，轻轻压平，等边缘干一点，用透明指甲油涂一圈固定（防止液体漏出）
3. 暂时不拍就放4℃冰箱避光存着，尽快用激光共聚焦显微镜拍照（记得选对荧光通道哦！）
? 小提醒：
• 全程轻柔操作，别冲掉细胞！
• 二抗和DAPI一定要避光，否则荧光会“跑掉”！
• 爬片取放用镊子，别用手碰，防止污染！
收藏这篇，跟着步骤做，新手也能轻松搞定免疫荧光~
1. 找状态好的细胞，倒掉旧培养基，加消化液让细胞脱落，轻轻吹打成单细胞悬液。
2. 把圆形爬片放进24孔板里（每个孔放一片）
3. 根据细胞生长快慢，取适量细胞悬液加到有爬片的孔里，放进37℃培养箱让细胞贴壁生长
二、固定细胞
1. 倒掉培养基，用PBS洗细胞3次（每次轻轻晃一晃，洗掉残留培养基）
2. 每孔加1mL的4%多聚甲醛，室温固定10-20分钟（让细胞“定格”，防止蛋白跑掉）倒掉多聚甲醛。
3. 再用PBS洗2次，每次5分钟（洗去多聚甲醛残留）
三、通透处理
1. 每孔加1mL的0.5% Triton-X100（让细胞膜“变通透”，方便抗体进去），室温放10分钟，倒掉
2. 用PBS洗2次，每次5分钟（洗掉Triton-X100，避免影响后续抗体结合）
四、封闭杂信号
每孔加1mL的3% BSA封闭液（用牛血清蛋白堵住细胞表面非特异性结合位点），室温放1小时，倒掉
五、一抗孵育（关键！）
1. 把一抗按说明书稀释好，滴在爬片上（别滴太多，能盖住细胞就行）用锡箔纸包住孔板避光，放4℃冰箱过夜（让抗体和目标蛋白“一对一结合”）
2. 第二天用PBS洗5次，每次5分钟（洗去未结合的一抗，减少背景杂色）
六、二抗孵育（显色关键）
1. 用封闭液稀释二抗（二抗能“抓住”一抗，自带荧光标签）室温避光孵育1小时（别让荧光二抗见光，会失效）
2. 用PBS洗5次，每次5分钟（彻底洗掉未结合的二抗，避免荧光干扰）
七、DAPI染细胞核
1. 按1:4000稀释DAPI（蓝色荧光染核，按试剂盒说明来）每孔加1mL，避光染10分钟（别太久，核会太亮）
2. 用PBS洗3次，每次5分钟（洗掉多余DAPI，防止非特异性染色）
八、封片和拍照
1. 用镊子小心夹出爬片，用吸水纸吸掉多余液体（别碰到细胞！）在载玻片上滴5μL抗荧光淬灭剂（防止荧光“褪色”）
2. 把爬片细胞面朝下盖在液滴上，轻轻压平，等边缘干一点，用透明指甲油涂一圈固定（防止液体漏出）
3. 暂时不拍就放4℃冰箱避光存着，尽快用激光共聚焦显微镜拍照（记得选对荧光通道哦！）
? 小提醒：
• 全程轻柔操作，别冲掉细胞！
• 二抗和DAPI一定要避光，否则荧光会“跑掉”！
• 爬片取放用镊子，别用手碰，防止污染！
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